張曉娜， 盧明華*， 徐林芳， 校 瑞， 蔡宗葦

（1.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封475004；2.香港浸會(huì)大學(xué)化學(xué)系，香港999077）

植物激素作為植物體內(nèi)廣泛存在的一類痕量信號(hào)分子，對(duì)于調(diào)節(jié)植物的各種生長發(fā)育過程和環(huán)境應(yīng)答具有非常重要的意義，根據(jù)其化合物結(jié)構(gòu)和作用不同可以分為植物生長素、細(xì)胞分裂素（CK）、脫落酸（ABA）、乙烯、赤霉素（GAs）、聚胺類、茉莉酸、水楊酸和油菜素甾醇等［1］。GAs是植物體內(nèi)一種四環(huán)雙萜類化合物，1934年由日本植物病理學(xué)家Teijiro Yabuta等在惡苗病菌的發(fā)酵濾液中得到［2］，隨后人們便開始對(duì)其進(jìn)行研究。GA3是第一個(gè)被鑒定的赤霉素，至今已鑒定出 136 種赤霉素［3，4］。這些化合物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上均含有赤霉素烷骨架（即4個(gè)環(huán)），僅環(huán)上雙鍵、羥基數(shù)目和位置不同。目前發(fā)現(xiàn)僅GA1、GA3、GA4和 GA7等少數(shù) GAs具有生物活性，其余均為活性GAs分子的代謝物或中間產(chǎn)物［5，6］。GAs亦可根據(jù)其分子內(nèi)所含碳原子數(shù)的不同分為兩類：分別是C20-赤霉素（C20-GAs）和C19-赤霉素（C19-GAs）。C19-GAs由 C20-GAs在代謝反應(yīng)過程中丟失第20位碳，10位碳又與19位碳上的羧基形成一個(gè)內(nèi)酯橋鍵（其結(jié)構(gòu)如圖1所示），C19-GAs所包含的種類較多，生理活性也比C20-GAs 要高［7，8］。

圖1 C－19和C－20赤霉素的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of C－19 and C－20 gibberellins

作為內(nèi)源性的植物激素，GAs在植物體內(nèi)的含量通常很低（一般為ng／g，甚至為pg／g水平），且共存的基體成分繁雜，在植物體內(nèi)各器官中其濃度表現(xiàn)出一定的波動(dòng)。另一方面，由于GAs在促進(jìn)植物種子萌發(fā)、表皮細(xì)胞分裂增長、莖葉擴(kuò)大伸長以及花蕾發(fā)育等方面具有良好的生理作用，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，但食品中GAs的殘留也成為食品安全的隱患，其安全性也備受關(guān)注［9，10］。由于該類化合物沒有特征生色基團(tuán)，沒有強(qiáng)的紫外、熒光和顯著的化學(xué)反應(yīng)［11］。因此，如何準(zhǔn)確可靠的實(shí)現(xiàn)痕量GAs的定性和定量分析成為植物科學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展瓶頸。

隨著高效、快速的分離技術(shù)（如超高效液相色譜、毛細(xì)管電泳／電色譜）及高選擇性和高靈敏檢測技術(shù)（如軟電離生物質(zhì)譜）的出現(xiàn)，近年來痕量GAs的分析檢測實(shí)現(xiàn)了重大突破。本文對(duì)近年來發(fā)表的基于色譜-質(zhì)譜技術(shù)的GAs的分析檢測方法（含樣品前處理技術(shù)）進(jìn)行綜述，以期對(duì)GAs相關(guān)的研究提供幫助。

1 赤霉素樣品前處理技術(shù)

樣品前處理步驟作為色譜分析中最為重要的環(huán)節(jié)之一，其好壞不僅決定著整個(gè)分析過程的長短，同時(shí)也關(guān)系到分析結(jié)果的準(zhǔn)確與否。由于GAs在植物體內(nèi)不僅含量極低，而且所處的樣品基質(zhì)非常復(fù)雜，因此開發(fā)高效、快速的樣品前處理技術(shù)對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行純化或富集成為GAs分析的關(guān)鍵步驟。目前GAs分析過程中常用的樣品前處理技術(shù)主要有固相萃?。⊿PE）、液相萃?。↙PE）、液相微萃?。↙PME）以及分子印跡萃?。∕IE）等，中國科學(xué)院大連化物所關(guān)亞風(fēng)研究員課題組［12］對(duì)植物激素樣品的前處理方法進(jìn)行了詳細(xì)綜述，下面僅針對(duì)GAs樣品的前處理技術(shù)進(jìn)行簡單總結(jié)。

1.1 固相萃取

SPE具有操作簡單、重現(xiàn)性好，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，也是目前應(yīng)用最為廣泛的樣品除雜純化方法之一。目前，C18-SPE法是GAs樣品前處理的常用方法，陳小鵬等［13］將成熟黃瓜樣品經(jīng)100%冷乙腈處理抽濾，去除色素和雜質(zhì)后，用乙酸乙酯提取激素，以甲醇-水（含5%冰乙酸）作為流動(dòng)相，在μ-Band pak C18柱上分離后，通過高效液相色譜實(shí)現(xiàn)了黃瓜樣品中 GA3含量的測定，回收率達(dá)到80.12%。Bastiá等［14］用乙酸乙酯提取樣品中游離的赤霉素（GA1和GA3），用10%甲醇進(jìn)行稀釋后注入反相C18色譜柱內(nèi)萃取，并與HPLC聯(lián)用對(duì)固氮醋酸菌和草螺菌中的GA1和GA3的含量進(jìn)行了測定。Yu等［15］建立了在線固相萃取與 LC-MS／MS的聯(lián)用技術(shù)，對(duì)葡萄中ABA、GA3、吲哚乙酸等5種酸性內(nèi)源性植物激素進(jìn)行檢測，采用3 mm×4 mm的C18萃取柱，將樣品富集在柱上以后，采用10%（v／v）的甲醇水溶液以0.6 mL／min流速清洗5 min，樣品提純后經(jīng)HPLC-MS檢測，GA3的 LOD和 LOQ分別為0.39 μg／kg 和1.32 μg／kg。黃紅林等［16］以丙酮水溶液（丙酮和水的體積比為5∶1）作提取液，分別研究了C18萃取柱、硅膠、β-環(huán)糊精鍵合固定相、50目碳納米管等4種固相萃取材料對(duì)番茄中GA3的富集行為，研究發(fā)現(xiàn)C18-SPE的凈化效果最好，可以去除提取液中可溶性的酯、糖等雜質(zhì)，該方法的LOD 為0.011 mg／L （S／N=3）。當(dāng)植物體中含有大量的非極性基質(zhì)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的基質(zhì)干擾峰，因此C18柱常常用于基質(zhì)不太復(fù)雜的樣品。

1.2 液相萃取

傳統(tǒng)的LPE是利用混合各組分對(duì)某一溶劑的不同溶解度而使各組分得到分離和提純的操作過程，王豐莉等［17］建立了異丙醇／硫酸銨-水溶液組成的醇鹽-水雙液相萃取體系，對(duì)GA3進(jìn)行了提取。研究表明：體系酸度pH=4.0，醇鹽比（異丙醇／硫酸銨）為 1.5 mL／4.3 g，在 GA3質(zhì)量濃度小于0.064 g／L時(shí)，提取率達(dá)到 93.47%，富集倍數(shù)11.36，提取液經(jīng)由氣相色譜檢測，在最佳條件下，以0.06 g／L的GA3樣品做回收試驗(yàn)，回收率可達(dá)到93.5%，RSD為4.0%。選擇恰當(dāng)溶劑對(duì)樣品液中的GAs進(jìn)行提取和純化，進(jìn)一步提高富集倍數(shù)的雙液相萃取技術(shù)，有著廣闊的發(fā)展空間。

1.3 液相微萃取

常規(guī)的LPE，不僅樣品需求量大，而且需要消耗大量有機(jī)溶劑，容易造成環(huán)境污染，從“綠色”化學(xué)的角度出發(fā)，LPME越來越受到重視。Li等［18］通過分散液相微萃?。―LLME）對(duì)水果樣品進(jìn)行富集凈化，實(shí)驗(yàn)裝置簡單，原料廉價(jià)，僅需少量有機(jī)溶劑便可達(dá)到良好的富集效果，實(shí)驗(yàn)以1.2 mL丙酮作為分散劑、100 μL的CHCl3作為萃取劑，混合后迅速注入樣品溶液，以2-（5-苯并吖啶）對(duì)甲苯磺酸乙酯（BAETS）作為熒光標(biāo)記試劑，通過HPLC-FLD進(jìn)行檢測，單次實(shí)驗(yàn)檢測出了茉莉酸、吲哚-3-乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸、GA3等8種植物激素。Wu等［19］采用中空纖維基質(zhì)液-液-液微萃取（HF-LLLME）技術(shù)，選擇環(huán)己醇和辛醇（1∶3，v／v）作為有機(jī)膜，在30℃的溫度下萃取90 min，通過高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)對(duì)大米樣品中的GA1、GA3、GA4等8種GAs進(jìn)行了分析，獲得了較好的檢測結(jié)果。

LPME從萃取方法上可分為單滴微萃取、室溫離子液體萃取、濁點(diǎn)萃取等。單滴微萃取是通過一滴萃取液滴實(shí)現(xiàn)，整個(gè)萃取過程僅需微升級(jí)甚至更少的有機(jī)溶劑，是目前有機(jī)溶劑使用量最少的一種液相微萃取方式。北京大學(xué)劉虎威教授課題組［20］開發(fā)了一種單滴液-液-液微萃?。⊿D-LLLME）與實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜（DART-MS）聯(lián)用技術(shù)，對(duì)果汁樣品中的吲哚乙酸、茉莉酸、GA3、脫落酸等6種植物激素實(shí)現(xiàn)了在線檢測。

1.4 分子印跡萃取

MIE是通過制備一種具有分子特異識(shí)別功能的印跡聚合物，將其作為SPE填料或SPME涂層應(yīng)用于食品、環(huán)境、生物樣品中目標(biāo)物的凈化與富集的技術(shù)，具有選擇性高等優(yōu)點(diǎn)。中山大學(xué)李攻科教授課題組［21］通過微波輻射合成了一種新型磁性GA3分子印跡聚合物（GA3-Mag-MIP），研究發(fā)現(xiàn)GA3與丙烯酰胺（AM）的結(jié)合強(qiáng)度要比GA3與其他功能單體的結(jié)合強(qiáng)度高出許多，而且GA3-Mag-MIP對(duì)目標(biāo)化合物有較高的選擇性和萃取能力（～708.4 pmol GA3），作者將 GA3磁性丙烯酸分子印跡聚合物（GA3-Mag-AM-MIP）作為萃取填料，對(duì)大米和黃瓜樣品中的 GA1、GA3、GA4、GA7提純富集，通過 HPLCMS進(jìn)行分析，結(jié)果顯示4種目標(biāo)化合物的LOD在1.9～4.4 μg／L（S／N=3）之間，RSD 為2.6% ～7.0%，大米和黃瓜樣品的加標(biāo)回收率分別為76.0%～109.1%和79.9%～93.6%，RSD為2.8%～8.8%和3.1%～7.7%，該方法在實(shí)際大米樣品中檢測出了GA4，其含量為（121.5 ±1.4）μg／kg。

2 赤霉素類植物激素的分析方法

傳統(tǒng)的植物激素檢測方法主要有生物鑒定法和理化測定法兩種，生物鑒定法是最早采用的植物激素測定方法，通過植物的組織和器官對(duì)赤霉素產(chǎn)生的特異性反應(yīng)進(jìn)行測定，生物鑒定法雖然操作簡單，但對(duì)樣品的純度要求很高，需要多重的樣品前處理步驟來實(shí)現(xiàn)，而且它的重復(fù)性和專一性較差，因此該方法的應(yīng)用逐漸減少。植物激素檢測中運(yùn)用較多的還有免疫測定法，它是基于抗原和抗體的特異性結(jié)合而建立起的一種檢測方法，具有良好的專一性，但是易受到交叉反應(yīng)的干擾，同時(shí)抗體制備時(shí)間較長，使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期延長，因此用這種方法對(duì)赤霉素進(jìn)行檢測的報(bào)道較少。理化法中除了常見的色譜法以外，還有電化學(xué)法［22］和光譜法［23］等，如 Murillo Pulgarín 等［24］利用光化學(xué)誘導(dǎo)熒光法，通過化學(xué)衍生對(duì)西紅柿中的GA3進(jìn)行檢測，在50～150 ng／mL范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，GA3的LOD為1.7 ng／mL，但該方法需多步提取凈化，操作繁瑣且專一性較差，目前將其與色譜方法結(jié)合進(jìn)行光譜測定成為GAs檢測的主流方法之一。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的出現(xiàn)，特別是隨著軟電離質(zhì)譜的發(fā)展，使得多種結(jié)構(gòu)類似的GAs同時(shí)分離分析成為可能，本文著重介紹了近年來色譜-質(zhì)譜技術(shù)在赤霉素檢測方面的應(yīng)用。

2.1 GC－MS 聯(lián)用技術(shù)

由于單次檢測可以同時(shí)鑒定出400多種化合物，GC-MS聯(lián)用技術(shù)用于GAs分析的研究工作開始于19 世紀(jì) 60 年代［25］。Yang 等［26］采用 GC-MS技術(shù)對(duì)蘋果樣品中的7種內(nèi)源性GAs（GA12、GA15、GA53、GA44、GA19、GA20和 GA3）進(jìn)行了檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GA20含量最多，GA19和GA14次之，GA3含量為 GA20含量的 1／3。黃紅林等［27］通過固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（SPE-GC-MS）技術(shù)對(duì)果品中的赤霉酸（GA3）殘留進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)通過選擇離子監(jiān)測（SIM）模式消除樣品中基體的干擾，提高檢測靈敏度，方法的線性范圍為0.11～3300 mg／L，LOD為0.11 mg／kg，回收率在75.3% ～101.3%之間。Nakayama等［28］運(yùn)用GC-MS技術(shù)在未成熟的碧桃種子中檢測到11種已知的內(nèi)源性赤霉素（GA3、GA9、GA17、GA19、GA30、GA44、GA61、GA63、GA87、GA95和GA97），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了未知的GAs，并通過已知的GAs證實(shí)了他們所預(yù)測的結(jié)構(gòu)，其中GA118和GA119是在高等植物中首次檢測到的含有 1α-羥基的GAs，從而豐富和完善了赤霉素類植物激素的種類。Taylor等［29］采用GC-MS分析了草莓葉片在短日照的條件下分泌物中GAs的含量：調(diào)節(jié)pH為8.0，實(shí)驗(yàn)樣品用乙酸乙酯溶解后，經(jīng)C18柱分離提純，通過全掃描質(zhì)譜圖譜和Kovats保留指數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中含有 GA1、3-epi GA1、GA3和 GA3-異內(nèi)酯。

2.2 HPLC 技術(shù)

赤霉素類植物激素對(duì)溫度十分敏感，溫度超過40℃就會(huì)發(fā)生快速分解，避免了高溫試驗(yàn)條件的HPLC技術(shù)近年來被廣泛應(yīng)用于GAs的分析研究［12］。但由于GAs沒有特征生色基團(tuán)，沒有強(qiáng)的紫外吸收、熒光和顯著的化學(xué)反應(yīng)，常規(guī)的HPLC技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)對(duì)該類化合物的靈敏分析，往往需要特定的檢測器或?qū)ζ溥M(jìn)行衍生化處理。Li等［30］建立了 HPLC-FLD 測定方法，以 2-（11H-苯［a］咔唑）乙基氯甲酸酯（BCETS）為標(biāo)記試劑進(jìn)行柱前熒光標(biāo)記，同時(shí)檢測出7種植物激素，包括吲哚乙酸、茉莉酸、GA3等，該方法中7種植物激素的LOD均在0.34 ～0.73 ng／mL 之間。Li等［18］以 2-（5-苯并吖啶）對(duì)甲苯磺酸乙酯（BAETS）作為熒光標(biāo)記試劑進(jìn)行HPLC-FLD分析，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，茉莉酸、吲哚-3-醋酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸、GA3等8種植物激素的 LOD 為 0.19 ～0.44 ng／mL （S／N=3），其中GA3在荔枝樣品中的LOD為21.71 ng／g，在櫻桃樣品中的 LOD為1.34 ng／g。該方法的準(zhǔn)確度在92.32%～103.10%之間，日內(nèi)保留時(shí)間和峰面積的RSD分別小于0.04%和3.8%，日間保留時(shí)間和峰面積的RSD分別小于0.97%和5.4%，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與FLD聯(lián)用的HPLC檢測技術(shù)適用于復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)植物激素的痕量分析。

2.3 LC－MS 聯(lián)用技術(shù)

由于克服了GC-MS需要衍生的缺點(diǎn)，LC-MS聯(lián)用技術(shù)近年來在GAs的檢測、發(fā)現(xiàn)及生物活性研究方面發(fā)揮了巨大作用［31］。Pan 等［32，33］采用高效液相色譜-電噴霧電離質(zhì)譜（HPLC-ESI／MS）技術(shù)對(duì)新鮮擬南芥組織中的植物激素（生長素、GAs、分裂素等）進(jìn)行了分析，經(jīng)過一級(jí)提取后，樣品回收率達(dá)到95%之上，在S／N＞10的情況下，赤霉素的LOQ為0.1～1 pg／g（鮮重）。中國科學(xué)院大連化物所關(guān)亞風(fēng)研究員課題組［34］將擬南芥樣品與C18混合研磨制成基質(zhì)固相分散（MSPD）萃取柱，開發(fā)了基質(zhì)固相分散萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（MSPD-HPLC-MS／MS）技術(shù)，在負(fù)離子電噴霧電離（ESI-）和多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下，同時(shí)測定了擬南芥組織中的3種赤霉素（GA1、GA3和 GA4）；實(shí)驗(yàn)選用 Merck RPC18色譜柱，柱溫25 ℃，單次進(jìn)樣5 μL，結(jié)果表明，3種GAs在10～300 ng／g的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2為0.984 2～0.996 2），LOD在1.1～4.1 ng／g之間（S／N=3），LOQ 在 3.7 ～10.3 ng／g之間（S／N=10），在 10 ～50 ng／g 的添加水平下回收率在54.7%～102.6%范圍內(nèi)，RSD為3.2%～12.8%；進(jìn)一步分析檢測數(shù)據(jù)得出，在3份不同的擬南芥樣品中GA1的含量最高，GA4次之，GA3最少。該方法將MSPD樣品前處理技術(shù)與色譜技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了擬南芥中3種GAs的痕量測定，同時(shí)也為植物樣品中痕量生物激素的分析檢測提供了參考。

張軍等［35］在 ESI-和 MRM 模式下，建立起HPLC-ESI／MS檢測葡萄中吡效隆和赤霉素的方法，采用Strata-X小柱萃取提純樣品，一次進(jìn)樣5 μL，選擇 Agilent SB-C18色譜柱，調(diào)節(jié)流速為 0.3 mL／min，柱溫40℃進(jìn)行檢測，結(jié)果表明兩種化合物在2.0～100.0 μg／L范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（r）＞0.999，赤霉素的 LOD 為0.3 μg／L（S／N=3），LOQ 為1.0 μg／L （S／N=10），回收率為90.3% ～94.2%，RSD為3.2% ～6.9%，均達(dá)到了檢測要求。Flores等［36］建立了一種基于快速、簡單、便宜、有效、堅(jiān)固、安全（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe，QuEChERS）的萃取方法，結(jié)合超高效液相色譜-質(zhì)譜（UPLC-MS）技術(shù)成功測定了西葫蘆樣品中的3種植物激素（生長素、CK、GA3），其中GA3的線性范圍在10～250 μg／kg之間（R2=0.998 5），LOD（S／N=3）和 LOQ（S／N=10）分別為 5 μg／kg 和 10 μg／kg。黃何何等［37］采用同樣方法將植物樣品經(jīng)QuEChERS法處理后，選取 Agilent XDB-C18色譜柱，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法定量。在最優(yōu)的色譜條件和檢測環(huán)境下，成功檢測了水果中矮壯素、助壯素、GA3、ABA等在內(nèi)的21種植物生長調(diào)節(jié)劑的殘留量，其中GA3在蘋果、梨、草莓、葡萄和橘子5種水果樣品中的 LOD均為6 μg／kg，LOQ為15 μg／kg，樣品平均回收率在73.0% ～111.0%之間，RSD 為3.0% ～17.2%。在10.0～1 000 μg／L范圍內(nèi)，R2均大于0.99，表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。從數(shù)據(jù)來看，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)多種水果樣品中21種植物生長殘留劑的檢測，有效地提高了檢測通量和檢測速度。

Sun等［38］利用穩(wěn)定同位素稀釋法（SIDA）測定了番茄醬中赤霉素的殘留，通過LC-MS技術(shù)同時(shí)檢測出番茄醬樣品中的3種GAs（GA3、GA4和GA7），結(jié)果顯示，GA3和 GA4的 LOD 為2 ng／g，GA7的LOD為0.3 ng／g，GA3和 GA4的線性范圍為5～500 ng／g，GA7的線性范圍為 1 ～100 ng／g，日內(nèi)和日間實(shí)驗(yàn)的RSD分別為4.8%～9.4%和3.5%～11.9%，3種GAs外標(biāo)法（ESM）和內(nèi)標(biāo)法（ISM）的回收率分別為42.6%～75.0%和91.1%～103.8%。Xie等［39］建立了在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的LC-MS檢測水果（蘋果、桃子、葡萄等）中GA3含量的分析方法，實(shí)驗(yàn)表明，該方法具有良好的線性和選擇性，LOQ 為10 μg／kg，在 3 個(gè)不同水平（10、20 和 200 μg／kg）的加標(biāo)樣品中，平均回收率達(dá)到77.8% ～96.2%，RSD小于13.7%，該方法操作簡單，可用作水果中GA3的常規(guī)分析，此方法已運(yùn)用于百余種水果中GA3的檢測。武漢大學(xué)馮鈺锜教授課題組［40］制備了一種陰離子交換／疏水聚合物整體柱，開發(fā)了一種基于該整體柱的毛細(xì)管液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（cLC-MS）方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)多種目標(biāo)GAs的分離，LOD 在0.62 ～0.90 fmol之間（S／N=3）。

Zhao等［41］建立了一種快速、高效、靈敏地檢測水果和蔬菜中GA3含量的方法，將樣品溶液的pH調(diào)節(jié)到3～4，用乙酸乙酯提取后經(jīng)SPE-PAK-C18分離提純，提純后的溶液經(jīng)HPLC-MS／MS檢測，采用外 標(biāo) 法 定 量，LOD 為 0.01 μg／mL。Urbanová等［42］采用UPLC-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)20種GAs的分析，方法的LOD在0.08～10 fmol之間，線性范圍超過 4個(gè)數(shù)量級(jí)。Chiwocha等［43］采用 LC-ESIMS／MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)休眠狀態(tài)下種子中 GA1、GA3、GA4和GA7含量的測定，發(fā)現(xiàn)在種子發(fā)芽之后GA1含量明顯降低。中國科學(xué)院大連化物所關(guān)亞風(fēng)研究員課題組［19］采用中空纖維液-液-液微萃?。℉F-LLLME）技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，通過高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測出大米樣品中的8 種 GAs （GA1、GA3、GA4、GA7、GA8、GA9、GA19和GA20），在最佳條件下，此方法表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，R2在0.995 52～0.999 91之間，LOD在0.001 6～0.061 ng／mL 的范圍內(nèi)。Liu 等［44］采用反相陽離子（Oasis MCX）和反相陰離子（Oasis MAX）交換混合機(jī)制柱對(duì)24種植物激素進(jìn)行兩級(jí)SPE，單次進(jìn)樣可以同時(shí)檢測出植物組織中24種甚至更多的微量植物激素，包括生長素、11種分裂素以及10種GAs（GA1、GA3、GA4、GA9、GA12、GA19、GA20、GA34、GA44和GA53），由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得，GAs的 LOD在0.2 ng／g左右，分裂素的 LOD 為 0.01 ng／g，脫落酸的LOD為0.1 ng／g，且均表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系（R2為0.990 3～0.999 7），該方法已成功運(yùn)用于數(shù)百種植物中不同組織的植物激素測定，包括草本類、藤本類以及木本類植物。

Kojima等［45］開發(fā)了一種基于質(zhì)譜探針（MS-probe）的高效和高通量的LC-MS／MS技術(shù)用于分析檢測植物激素，通過被分析物（植物激素）與2-溴乙基-三甲基溴化銨（BETAB）反應(yīng)，使得植物激素含有一個(gè)帶正電荷的基團(tuán)，在質(zhì)譜正離子模式下對(duì)分裂素、生長素、脫落酸和GAs等43種植物激素進(jìn)行了分離檢測，相對(duì)于常規(guī)的負(fù)離子模式LOD提高了50倍。武漢大學(xué)馮鈺锜教授課題組［46］采用SPE與液液萃取（LLE）串聯(lián)方法提純酸性植物激素（含10種 GAs），通過化學(xué)修飾 3-溴丙酮基溴化胺（BTA）來提高酸性植物激素在ESI-MS正離子模式下的離子化效率，從而提高方法的檢測靈敏度，使得方法的 LOD 達(dá)到 1.05 ～122.4 pg／mL（S／N=3），RSD低于11.9%，大米加標(biāo)樣品中目標(biāo)分析物的回收率達(dá)到88.3%～104.3%，該方法可從5 mg大米樣中定量檢測出11種內(nèi)源酸性植物激素。

Izumi等［47］發(fā)展了一種納升液相色譜-電噴霧-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用（LC-ESI-IT-MS／MS）測定植物激素（CK、ABA以及 GAs）的方法，比毛細(xì)管流 LCESI-IT-MS／MS的靈敏度要高出5～10倍，部分GAs的 LOD 低至飛摩爾級(jí)別（≤10-15mol，S／N=3），結(jié)果顯示所有目標(biāo)化合物的線性相關(guān)系數(shù)（R2）在0.9937～1.0000之間，保留時(shí)間RSD小于1.1%，峰面積RSD低于10.7%，該分析方法為復(fù)雜痕量植物激素樣品的深入研究提供了一種解決方案。

2.4 CE－MS 聯(lián)用技術(shù)

CE-MS由于具有樣品需求量小，溶劑消耗量少等優(yōu)點(diǎn)，近年來也被應(yīng)用到赤霉素類植物激素的分析檢測中。Ge等［48］開發(fā)了一種基于C18固相萃取柱的CE-MS方法，在25 min內(nèi)從椰汁樣品中分離鑒定出 11 種 GAs（GA1、GA3、GA4、GA5、GA6、GA7、GA13、GA19、GA20、GA24和 GA53），方法的 LOD 在0.31 ～ 1.02 μmol／L 之間。隨后該課題組［49］發(fā)展了膠束電動(dòng)色譜-質(zhì)譜（MEKC-MS）分析GAs的技術(shù)，在 25 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì) GA1、GA3、GA5、GA6、GA7、GA9、GA12和 GA13等 8 種 GAs 的分離和檢測，并將該方法結(jié)合SPE應(yīng)用到椰汁樣品的分析，成功檢測并定量了椰汁樣品中的GA1和GA3。

武漢大學(xué)馮鈺锜教授課題組［50］合成了3-溴丙酮基溴化銨（BTA）作為一種新的質(zhì)譜探針，開發(fā)了基于BTA化學(xué)修飾的毛細(xì)管電泳-電噴霧電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜（CE-ESI-TOF-MS）技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)15種酸性植物激素（含 10 種 GAs：GA1、GA3、GA4、GA20、GA7、GA9、GA12、GA19、GA24、GA53）的快速靈敏分析，方法的 LOD為0.34～4.59 ng／mL，LOQ為1.12～15.3 ng／mL，標(biāo)準(zhǔn)樣品液中目標(biāo)化合物的回收率為84.6%～112.2%，日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)的RSD分別低于6.7%和9.9%，顯示了較好的重現(xiàn)性。

3 總結(jié)和展望

目前，赤霉素類植物激素的分析檢測仍是生物化學(xué)和農(nóng)業(yè)化學(xué)研究的熱點(diǎn)，以高效液相色譜法為代表的理化檢測仍是GAs檢測的主流方法。在色譜技術(shù)發(fā)展的同時(shí)，GAs殘留的生物盒檢測也是一個(gè)重要的發(fā)展方向，將化學(xué)技術(shù)和生物技術(shù)做到有效結(jié)合，降低檢測成本，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速測定。

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