徐 幸,張曉鳴,張 燕,舒 平,彭飛進

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心,云南大理 671000)

穩(wěn)定性同位素稀釋-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定腐竹中的烏洛托品

徐 幸1,2,張曉鳴1,*,張 燕2,舒 平2,彭飛進2

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122;2.大理州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心,云南大理 671000)

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)和穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù),建立了測定腐竹中烏洛托品的分析方法。以乙腈為提取溶劑,向腐竹樣品中加入烏洛托品的穩(wěn)定性同位素,經(jīng)固相萃取柱凈化,采用HILIC色譜柱分離,目標(biāo)物在UPLC-MS/MS的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下,內(nèi)標(biāo)法定量。該方法在1～40 μg/L范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9996,方法定量限為2 μg/kg。在添加水平為2、10、30 μg/kg時,平均回收率為97.8%～101.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.9%～4.8%。本方法靈敏度高,準(zhǔn)確度和重復(fù)性好,可為作為檢測腐竹中違法添加烏洛托品的方法。

穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù),超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,烏洛托品,腐竹

烏洛托品(Urotropine),化學(xué)名稱為1,3,5,7-四氮雜三環(huán)[3.3.1.1]癸烷,分子式為C6H12N4,常用于醫(yī)藥和化工領(lǐng)域[1],因其在酸性環(huán)境中會分解為甲醛而具有殺菌作用,常被用作防腐劑非法添加到食品中。因甲醛對人體的免疫功能以及消化系統(tǒng)有損害[2],早在2010年3月,中國就將烏洛托品列入食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單(第四批)[3]。但有監(jiān)管部門已發(fā)現(xiàn),部分生產(chǎn)者將烏洛托品非法添加到腐竹中,以延長其保質(zhì)期。然而我國尚無檢測腐竹中烏洛托品的國家標(biāo)準(zhǔn),僅有只適用于檢測動物源性食品的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2226-2008[4]。近年來,關(guān)于豆制品中烏洛托品的檢測方法已有文獻報道,主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6]、激光拉曼光譜法[7]以及液質(zhì)聯(lián)用法等[8-10],絕大多數(shù)都采用外標(biāo)法來定量,而外標(biāo)法的回收率不穩(wěn)定,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,這將導(dǎo)致檢測數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確。也有研究者用內(nèi)標(biāo)方法來定量,陸春良等[11]采用三聚氰胺作為內(nèi)標(biāo)對烏洛托品進行定量檢測,但兩者的化學(xué)性質(zhì)并非完全一致,這也會使檢測數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此,有必要建立一種更穩(wěn)定可靠的檢測方法。

穩(wěn)定性同位素稀釋技術(shù)用于食品檢測中,不僅能消除基質(zhì)效應(yīng)的影響,還可以使定量更準(zhǔn)確[12-13]。本實驗采用同位素標(biāo)記的烏洛托品作為內(nèi)標(biāo),超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定烏洛托品的含量,使得檢測方法的精密度和準(zhǔn)確度都得到顯著提高。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)

注:
注:*標(biāo)注的為定量離子對。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏洛托品、13C15N-烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品 購于Sigma公司,純度≥99%;色譜純甲醇、乙腈 購于Merck公司;乙酸銨 色譜純,購于Acros公司;所用其他試劑 均為分析純;實驗室用水 超純水;腐竹樣品 購于當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

Cleanert PCX固相萃取小柱 規(guī)格為60 mg/3 mL,購于Agela Technologies公司;0.22 μm尼龍濾膜 購于安譜科學(xué)儀器有限公司;QTRAP 4500串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、Ekspert ultraLC 100-XL超高效液相色譜儀 購于AB SCIEX公司;色譜柱為Phenomenex Luna 3μ HILIC,規(guī)格為100×2.0 mm,3μm;氮吹儀;超聲波清洗儀;AL204電子天平 購于Mettler toledo公司。

1.2 色譜-質(zhì)譜分析條件

液相色譜操作條件:流速:0.6 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣體積:5 μL;流動相:A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液,B為乙腈,梯度洗脫條件如表1。

表1 流動相的梯度洗脫程序

質(zhì)譜離子源選用電噴霧正離子掃描模式(ESI+);多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);離子源溫度為110 ℃;噴霧電壓為5500 eV;脫溶劑溫度為450 ℃;質(zhì)譜分析參考條件參見表2。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和曲線繪制

準(zhǔn)確稱取50 mg烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品與13C15N-烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈溶解并分別定容至50 mL,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液,避光保存于4 ℃冰箱中。再逐級稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液,將烏洛托品配制成1、2、5、10、20、30、40 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列,13C15N-烏洛托品在每個濃度點的濃度都為10 μg/L,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 樣品前處理

1.4.1 樣品的制備與提取 取有代表性樣品約100 g,用組織搗碎機搗碎,準(zhǔn)確稱取2.5 g試樣(精確到0.001 g)于50 mL比色管中,加入100 μg/L的13C15N-烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)溶液250 μL,用乙腈定容至25 mL,超聲提取15 min,用快速定性濾紙過濾,吸取10 mL濾液于40 ℃下氮吹濃縮近干后待凈化。

1.4.2 凈化 固相萃取柱使用前,先依次用3 mL甲醇、3 mL水活化,用2 mL甲醇溶解濃縮后的殘渣,并過固相萃取柱,再用3 mL水和3 mL甲醇淋洗固相萃取柱,棄去流出液,在15 mmHg以下減壓抽至柱體干涸,用5 mL 5%氨水-甲醇(v/v)洗脫并收集洗脫液,于40 ℃下氮氣吹干,準(zhǔn)確加入1 mL乙腈溶解殘渣,經(jīng)0.22 μm尼龍濾膜過濾,供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

采用針泵直接進樣的方式,分別對烏洛托品與13C15N-烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)溶液進行母離子掃描,以確定目標(biāo)物的準(zhǔn)分子離子,兩種物質(zhì)在正離子模式下靈敏度都比負離子模式下響應(yīng)高。再分別以準(zhǔn)分子離子m/z 141.1與m/z 151.3作為母離子,對其子離子進行全掃描,獲得了烏洛托品與13C15N-烏洛托品的質(zhì)譜圖,如圖1、圖2所示,由質(zhì)譜圖可以看出烏洛托品與13C15N-烏洛托品的特征離子,選擇其中響應(yīng)較高,干擾較小的離子對作為多反應(yīng)監(jiān)測的離子對,SN/T2226-2008推薦的參考離子對為m/z 141.1/98.2,而實際檢測時發(fā)現(xiàn)盡管此離子對的響應(yīng)較高,但樣品中的干擾也較大,故最終選擇了干擾較小的m/z 141.1/85.2作為參考離子對。在選定多反應(yīng)監(jiān)測的離子對后,對儀器的錐孔電壓、駐留時間以及碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化選擇,優(yōu)化后的參數(shù)見表2。

圖1 烏洛托品的全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Full scan mass spectrum of hexamethylenetetramine

圖2 13C15N-烏洛托品的全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Full scan mass spectrum of13C15N-hexamethylenetetramine

2.2 色譜條件的優(yōu)化

實驗考察了不同流動相對烏洛托品與13C15N-烏洛托品響應(yīng)的影響,包括水-乙腈、5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈等體系對質(zhì)譜響應(yīng)的影響,結(jié)果顯示采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈體系時烏洛托品與13C15N-烏洛托品的響應(yīng)最強,因此,最終選擇0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈體系作為流動相,并對流動相的梯度洗脫程序進行了優(yōu)化,優(yōu)化后的條件見表1,圖3為烏洛托品與13C15N-烏洛托品在此條件下的多反應(yīng)監(jiān)測圖。

圖3 多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring chromatogram

2.3 樣品前處理條件的選擇

烏洛托品溶于水、乙腈、甲醇、乙醇等極性溶劑。因腐竹中含有大量蛋白質(zhì),選擇提取溶劑時,需兼顧沉淀蛋白與提取目標(biāo)物的作用。有文獻報道[14-15]采用高氯酸或三氯乙酸的水溶液提取豆制品中的烏洛托品,但烏洛托品在酸性條件下易分解[3],因此本實驗選用非酸性溶劑乙腈、甲醇和乙醇等來提取烏洛托品,用乙醇提取時,烏洛托品的回收率低于50%,用乙腈和甲醇提取時回收率可達60%～70%,而乙腈提取的濾液色素含量較甲醇提取的低,最終采用了乙腈作為提取溶劑。

烏洛托品分子屬于多環(huán)叔胺結(jié)構(gòu),溶液呈堿性,在溶液中離子帶正電荷,因此需選擇能與目標(biāo)物發(fā)生離子交換的陽離子交換柱,已有文獻報道混合型陽離子交換柱的回收率,較其他類型的陽離子交換柱好[4,8,14-15],也有文獻報道,采用PXA陰離子交換小柱作為凈化柱用于烏洛托品的檢測[3,9],但陰離子交換柱的凈化原理是雜質(zhì)吸附于柱子中,目標(biāo)物直接隨溶劑流出,如樣品中含有大量鹽類,不能保證收集的流出液中不含鹽類,此凈化效果將不及陽離子交換柱。結(jié)合烏洛托品的化學(xué)性質(zhì),參考文獻的報道,本實驗采用混合型陽離子交換固相萃取柱作為凈化柱。

2.4 方法的線性范圍與檢出限

烏洛托品的標(biāo)準(zhǔn)系列在濃度范圍為1～40 μg/L時,校準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=0.1049X+0.0164(其中Y為烏洛托品對13C15N-烏洛托品的峰面積比,X為烏洛托品的濃度),線性相關(guān)系數(shù)為0.9996。根據(jù)10倍信噪比(S/N)計算該方法的定量限為2 μg/kg。同時考察了添加在腐竹中的烏洛托品MRM色譜圖,在目標(biāo)物保留時間附近,無明顯干擾物存在。

2.5 方法回收率與精密度

分別向腐竹樣品中添加濃度為2、10和30 μg/kg三水平的回收率實驗,每個濃度重復(fù)測定6次,結(jié)果見表3,采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,其平均回收率在97.8%～101.5%范圍,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%,方法的準(zhǔn)確度和精密度都符合分析要求,根據(jù)已有的文獻數(shù)據(jù),采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜-外標(biāo)法測定食品中的烏洛托品,汪輝等[8]測得的平均回收率在52.6%～118%范圍,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.1%～10.2%,馬雪濤等[14]測得的平均回收率在76.0%～83.6%范圍,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～5.8%,回收率與內(nèi)標(biāo)法比較偏低,且精密度和穩(wěn)定性也沒有內(nèi)標(biāo)法好,因此采用同位素內(nèi)標(biāo)法使得檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。此結(jié)果表明烏洛托品的絕對回收率難以達到100%,而穩(wěn)定性同位素13C15N-烏洛托品與其化學(xué)性質(zhì)類似,采用相同的提取凈化過程,兩者的絕對回收率較接近,當(dāng)采用兩者的比值作為相對回收率時,精密度與準(zhǔn)確度就得到顯著提高。

表3 烏洛托品在腐竹中的回收率和精密度實驗(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了針對腐竹樣品中烏洛托品的檢測方法,采用乙腈提取腐竹中的烏洛托品,同時沉淀了基體中的蛋白,采用烏洛托品的穩(wěn)定性同位素標(biāo)記物作為內(nèi)標(biāo),與常用的外標(biāo)法相比較,同位素稀釋法的相對回收率較高,定量檢測結(jié)果也更準(zhǔn)確。采用此法檢測了當(dāng)?shù)厥袌錾系?0個腐竹樣品,并未檢出烏洛托品。此方法操作簡便,準(zhǔn)確度和精密度較外標(biāo)法更好,可用于日常食品監(jiān)管部門對腐竹中烏洛托品的監(jiān)測。

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Determination of urotropine in bean curd sticks by stable isotopic dilution-liquid chromatography with tandem mass spectrometry

XU Xing1,2,ZHANG Xiao-ming1,*,ZHANG Yan2,SHU Ping2,PENG Fei-jin2

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision,Dali 671000,China)

A stable isotope dilution mass spectrometry technology for determination of urotropine in bean curd sticks by liquid chromatography with tandem mass spectrometry was developed. Isotopic urotropine was added to bean curd sticks as internal standard,and extracted with acetonitrile. Solid phase extraction(SPE)was applied to purify the sample. The separation was performed on a HILIC column. The analyte was determined by multiple reaction monitoring(MRM)mode with UPLC-MS/MS,and quantified by the internal standard method. The method showed good linear relationship in the range of 1～40 μg/L for urotropine,the correlation coefficient square was 0.9996. The limit of quantitation(LOQ)for sample was 2 μg/kg. The average recoveries were 97.8%～101.5% at spiked levels of 2,10,30 μg/kg. The relative standard deviation(RSD,n=6)was 1.9%～4.8%. This method is sensitive,accurate and reproducible. It is suitable for monitoring illegally added urotropine in bean curd sticks.

stable isotope dilution technology;ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;urotropine;bean curd sticks

2014-11-13

徐幸(1983-)，女，在讀博士，工程師，研究方向：食品安全質(zhì)量檢測，E-mail:amy911007@163.com。

*通訊作者:張曉鳴(1965-)，男，博士，教授，研究方向：食品安全質(zhì)量控制，E-mail:xmzhang@jiangnan.edu.cn。

云南省衛(wèi)生廳制修訂食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)項目(云衛(wèi)[2014]DB004)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)15-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.050