李 童,孫軍勇,吳殿輝,李曉敏,謝廣發(fā),陸 健,5,*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;4.中國(guó)紹興黃酒集團(tuán)有限公司 國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江紹興 312000;5.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,江蘇宿遷 223800)

YDL080C和LEU2基因敲除對(duì)工業(yè)黃酒酵母異戊醇生成量的影響

李 童1,2,3,孫軍勇1,2,3,吳殿輝1,2,3,李曉敏1,2,3,謝廣發(fā)3,4,*,陸 健1,2,3,5,*

(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,江蘇無(wú)錫 214122;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;4.中國(guó)紹興黃酒集團(tuán)有限公司 國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心,浙江紹興 312000;5.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院,江蘇宿遷 223800)

通過(guò)敲除生成途徑中關(guān)鍵酶的編碼基因,對(duì)異戊醇在工業(yè)黃酒酵母N85中的生成進(jìn)行了研究。采用融合PCR技術(shù),分別構(gòu)建類(lèi)丙酮酸脫羧酶基因(YDL080C)缺失組件“YDL080C-URA3-YDL080C”和β-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶基因(LEU2)缺失組件“LEU2-URA3-LEU2”,轉(zhuǎn)化工業(yè)黃酒酵母N85尿嘧啶缺陷型單倍體Na-u(MATa ura3),獲得單倍體工程菌Na-y和Na-l。將轉(zhuǎn)化子與親本分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果YDL080C缺失工程菌的異戊醇含量與親本相比沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明類(lèi)丙酮酸脫羧酶不是該途徑關(guān)鍵酶;LEU2缺失工程菌的異戊醇含量降低16.16%,說(shuō)明糖代謝途徑存在,但只占小部分,而其他理化指標(biāo)無(wú)明顯差異。

異戊醇,工業(yè)黃酒酵母,類(lèi)丙酮酸脫羧酶基因,β-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶基因,基因敲除

黃酒具有增強(qiáng)記憶能力、增強(qiáng)免疫能力、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種保健功能[1]。然而部分黃酒飲用后容易引起“上頭”,主要原因是酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物——高級(jí)醇特別是異戊醇含量較高[2]。1907年和1953年研究人員先后提出了高級(jí)醇產(chǎn)生的兩大途徑:一是氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑(Ehrlich途徑),即氨基酸先經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)氨作用形成酮酸,再被脫羧還原形成比原氨基酸少一個(gè)碳的高級(jí)醇;二是糖代謝途徑(Harris途徑),即由葡萄糖經(jīng)EMP途徑和TCA循環(huán)合成形成氨基酸的前體物——α-酮酸,再通過(guò)脫羧還原形成相應(yīng)的高級(jí)醇。異戊醇的兩種產(chǎn)生途徑如圖1所示[3-4]。

Dickenson等[5-7]證實(shí)了野生型葡萄酒酵母中異戊醇生成主要通過(guò)Ehrlich途徑,敲除類(lèi)丙酮酸脫羧酶的編碼基因(YDL080C基因),異戊醇生成量顯著降低,證明該酶是該途徑中的關(guān)鍵酶。而YDL080C基因缺失的工業(yè)白酒酵母工程菌,發(fā)酵液中異戊醇含量無(wú)明顯變化[8],證明該酶并非此途徑關(guān)鍵酶,或者異戊醇通過(guò)其它途徑合成。針對(duì)Harris途徑,佐一含等[9]構(gòu)建了LEU2基因(編碼β-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶)缺失的啤酒酵母工程菌,在氨基酸含量較低的培養(yǎng)基中發(fā)酵,發(fā)酵液中異戊醇含量降低了11.82%,證明工業(yè)啤酒酵母中糖代謝途徑生成異戊醇的存在,黃酒酵母中是否存在尚無(wú)研究。

上述研究結(jié)果說(shuō)明,采用基因工程方法打斷異戊醇的代謝通路,對(duì)釀酒酵母進(jìn)行有目的的改造,是降低異戊醇的有效方法,同時(shí),雖同為釀酒酵母,但由于遺傳背景不同,不同酒種釀酒酵母中異戊醇的生成途徑及關(guān)鍵酶可能存在差異。而目前尚無(wú)工業(yè)黃酒酵母中異戊醇的生成途徑和關(guān)鍵酶的研究。因此,本文針對(duì)工業(yè)黃酒酵母,采用自克隆技術(shù),以酵母遺傳工程中重要的遺傳標(biāo)記URA3為篩選標(biāo)記[10],通過(guò)構(gòu)建相關(guān)酶的編碼基因缺失菌株,判斷工業(yè)黃酒酵母中異戊醇的生成途徑,從而降低黃酒中異戊醇含量。

圖1 異戊醇生成途徑Fig.1 The pathway of isoamyl alcohol biosynthesis注：①:乙酰乳酸酶系；②:二羥酸脫水酶；③:α-異丙基蘋(píng)果酸合酶；④:β-異丙基蘋(píng)果酸脫水酶；⑤:β-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶；⑥:支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶；⑦:丙酮酸脫羧酶；⑧:類(lèi)丙酮酸脫羧酶。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

工業(yè)黃酒酵母N85尿嘧啶缺陷型單倍體Na(MATa ura3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存,由本實(shí)驗(yàn)室從工業(yè)二倍體菌株N85中通過(guò)敲除HO基因分離獲得的單倍體再構(gòu)建而成;Prime STAR DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶 寶生物工程(大連)有限公司;DNA膠回收試劑盒 生工生物工程(上海)有限公司;正丙醇、異丁醇、異戊醇、1-辛醇 GCS,Sigma公司;氯化鈉 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇 優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YPD培養(yǎng)基用于酵母菌的培養(yǎng)和保存;基本培養(yǎng)基(MM)用于篩選和驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子Na-Y和Na-L。

50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取頭、手動(dòng)進(jìn)樣手柄、SPME操作平臺(tái) 美國(guó)Supelco;Talboys數(shù)顯型磁力加熱攪拌器 美國(guó)Henry Troemner公司;CNW18-400螺紋口15 mL樣品瓶;Agilent GC7890A型氣相色譜儀(自帶氫火焰離子化檢測(cè)器) 安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中公布的釀酒酵母URA3基因、YDL080C基因和LEU2基因的核苷酸序列,設(shè)計(jì)了表1中的擴(kuò)增引物,所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所需的引物

圖2 工程菌酵母構(gòu)建示意圖Fig.2 Summary of the construction of an engineering yeast strain

1.2.2 YDL080C基因敲除組件的構(gòu)建 分別以YC-1/YC-2、YC-3/YC-4、YC-5/YC-6為引物,酵母基因組為模板,用ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增,純化回收PCR產(chǎn)物獲得YDL080C上游同源臂(YC-L)、兩端帶有重疊序列的“URA3”片段及YDL080C下游同源臂(YC-R)?；谌诤螾CR的原理[11],采用一種高效構(gòu)建基因組件的方法[12],以YC-L、“URA3”、YC-R為模板,用Prime STAR DNA聚合酶進(jìn)行融合PCR反應(yīng),再以融合PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板,YC-1/YC-6為引物,ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增,獲得YDL080C基因敲除組件,見(jiàn)圖2。

1.2.3 LEU2基因敲除組件的構(gòu)建 分別以L2-1/L2-2、L2-3/L2-4、L2-5/L2-6為引物,酵母基因組為模板,用ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增,純化回收PCR產(chǎn)物獲得LEU2上游同源臂(LEU2-L)、兩端帶有重疊序列的“URA3”片段及LEU2下游同源臂(LEU2-R)?；谌诤螾CR的原理,采用一種高效構(gòu)建基因組件的方法,以LEU2-L、“URA3”、LEU2-R為模板,用Prime STAR DNA聚合酶進(jìn)行融合PCR反應(yīng),再以融合PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板,L2-1/L2-6為引物,ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行融合片段的全長(zhǎng)擴(kuò)增,獲得LEU2基因敲除組件。

1.2.4 電轉(zhuǎn)化單倍體Na與轉(zhuǎn)化子的鑒定 黃酒酵母轉(zhuǎn)化采用高效電轉(zhuǎn)化法[13],轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布于現(xiàn)配的MM培養(yǎng)基,倒置于30 ℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出,分別以YC-1/YC-4、L2-1/L2-4為引物進(jìn)行菌落PCR初次驗(yàn)證,并對(duì)鑒定正確的轉(zhuǎn)化子Na-y和Na-l提取基因組,以YC-1/YC-6、L2-1/L2-6為引物再次驗(yàn)證?；厥照_的PCR擴(kuò)增條帶,測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 將工程菌株和出發(fā)菌株采用傳統(tǒng)方法同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室規(guī)模黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)[14],其中麥曲添加量為14%熟麥曲和3%生麥曲,酵母接種量為5%。

1.2.6 發(fā)酵液常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定 參考文獻(xiàn)[15]的方法。

1.2.7 高級(jí)醇的測(cè)定 參考已有文獻(xiàn)[16-18],采用SPME-GC-FID法測(cè)定。HS-SPME操作條件:在15 mL樣品瓶中依次加入2.5 g NaCl、6 mL試樣、100 μL內(nèi)標(biāo)和轉(zhuǎn)子,50 ℃攪拌平衡15 min,迅速將SPME萃取頭插入樣品瓶,萃取30 min。萃取結(jié)束后,取下萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口解析5 min。氣相色譜條件:采用HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度250 ℃;隔墊吹掃流量 3 mL/min;恒流1 mL/min;檢測(cè)器溫度250 ℃;H2流量:30.0 mL/min;空氣流量:400 mL/min;尾吹流量:25 mL/min。柱溫程序升溫:初始溫度40 ℃,恒溫4 min后以5 ℃/min升溫至120 ℃,再以8 ℃/min升溫至220 ℃,恒溫2 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):吸取色譜純的正丙醇、異戊醇、異丁醇等各10、20、30、40、50 μL于100 mL容量瓶中,用15%(v/v)的乙醇溶液定容至100 mL,配成五個(gè)梯度溶度的混合標(biāo)樣。吸取50 μL的1-辛醇于50 mL容量瓶,用無(wú)水乙醇定容至刻度,配成濃度為834 mg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Excel 2013進(jìn)行單因素方差分析,探究數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌的構(gòu)建與鑒定

2.1.1 基因敲除組件的構(gòu)建 按1.2.2和1.2.3中所述的融合PCR方法,分別獲得基因敲除組件“YDL080C-URA3-YDL080C”和“LEU2-URA3-LEU2”。圖3(A、B)的PCR驗(yàn)證結(jié)果表明:基因敲除組件大小分別為2328 bp和2224 bp,與預(yù)計(jì)片段大小相符,已經(jīng)融合成功。

2.1.2 基因敲除組件轉(zhuǎn)化單倍體Na-y和Na-l的鑒定 尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株無(wú)法在MM培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。根據(jù)這一特性,將轉(zhuǎn)化子涂布于MM培養(yǎng),初步鑒定能生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子為轉(zhuǎn)化正確的單倍體。如圖4所示。

提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA,分別以YC-1/YC-6、L2-1/L2-6為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。如圖5所示,轉(zhuǎn)化子有一條2328 bp大小的“YDL080C-URA3-YDL080C”擴(kuò)增片段,與預(yù)期結(jié)果相符;而陰性對(duì)照只能擴(kuò)增出1725 bp大小的YDL080C全基因片段,空白對(duì)照無(wú)任何條帶,證明YDL080C基因缺失組件已經(jīng)整合進(jìn)酵母工程菌的基因組。同理,圖6證明LEU2基因缺失組件已經(jīng)整合進(jìn)酵母工程菌的基因組。

表2 不同菌株黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)常規(guī)理化指標(biāo)

注:
注:同一列中,與Na組相比,*表示差異顯著(0.01

圖3 基因敲除組件的驗(yàn)證Fig.3 The fusion verification of Disruption cassette注:A:YDL080C基因敲除組件的驗(yàn)證;B:LEU2基因敲除組件的驗(yàn)證;1～2:基因敲除組件“YDL080C-URA3-YDL080C”;3～4:基因敲除組件“LEU2-URA3-LEU2”;M:10 kb Marker。

圖4 轉(zhuǎn)化子劃線(xiàn)于MM上鑒定Fig.4 The verification of transformants on MM plants注:1:轉(zhuǎn)化子Na-y;2:轉(zhuǎn)化子Na-l;3:對(duì)照Na-u(尿嘧啶缺陷型單倍體)。

圖5 轉(zhuǎn)化子Na-y的PCR擴(kuò)增鑒定Fig.5 The verification of Na-Y transformants by PCR注:M1:10 kb Marker;M2:2 kb Marker;1～2:轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物;3:陰性對(duì)照(出發(fā)菌株P(guān)CR產(chǎn)物);4:空白對(duì)照。

圖6 轉(zhuǎn)化子Na-l的PCR擴(kuò)增鑒定Fig.6 The verification of Na-L transformants by PCR注:M1:10 kb Marker;M2:2 kb Marker;1～2:轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物;3:陰性對(duì)照(出發(fā)菌株P(guān)CR產(chǎn)物);4:空白對(duì)照。

2.2 實(shí)驗(yàn)室規(guī)模黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

2.2.1 常規(guī)理化指標(biāo) 不同菌株黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn),各常規(guī)理化指標(biāo)如表2所示。從表2中看出,與出發(fā)菌株相比,Na-y的乙醇濃度和總糖差異顯著,推測(cè)菌體代謝過(guò)多總糖引起乙醇含量增多,除此外兩種工程菌株發(fā)酵的黃酒常規(guī)理化指標(biāo)無(wú)明顯差異,說(shuō)明基因敲除對(duì)黃酒常規(guī)理化指標(biāo)無(wú)顯著影響。

2.2.2 高級(jí)醇含量 不同菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)后測(cè)得的高級(jí)醇含量如表3所示。與出發(fā)菌株相比,YDL080C基因缺失菌株產(chǎn)生的異戊醇含量無(wú)明顯變化,與郝欣[8]在白酒工業(yè)酵母中的研究結(jié)果相同,與Dickinson[7]在葡萄酒釀酒酵母中的研究結(jié)果不一致,證明黃酒工業(yè)酵母中類(lèi)丙酮酸脫羧酶并不是異戊醇合成的關(guān)鍵酶。另一方面,LEU2基因缺失菌株異戊醇含量降低了16.16%。佐一含[9]在啤酒工業(yè)酵母中的研究認(rèn)為,在氨基酸豐富的情況下,不需要經(jīng)過(guò)糖代謝途徑生成氨基酸,所以異戊醇含量沒(méi)有顯著變化。但是黃酒釀造,屬于邊糖化邊發(fā)酵,葡萄糖利用率高,糖酵解生成大量丙酮酸,一方面丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán)),過(guò)程中產(chǎn)生α-酮戊二酸,α-酮戊二酸參與氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑生成異戊醇(圖1);另一方面,丙酮酸及丙酮酸脫羧生成活性乙醛,二者縮合,再經(jīng)異構(gòu)、還原、脫水等步驟生成α-酮異戊酸[4],后者與乙酰Co A縮合,再經(jīng)異構(gòu)、脫氫、脫羧等反應(yīng)生成α-酮異己酸,生成異戊醇(圖1)。該途徑產(chǎn)生的中間物α-酮異己酸較多,因此,黃酒釀造中,LEU2基因的缺失對(duì)結(jié)果的影響比較顯著?？梢杂脕?lái)構(gòu)建低產(chǎn)高級(jí)醇的工業(yè)黃酒酵母。

表3 不同菌株黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中高級(jí)醇的含量

注:
注:同一行中,與Na組相比,**表示差異極顯著(p<0.01),不標(biāo)者表示差異不顯著。

3 結(jié)論

本研究從工業(yè)黃酒酵母尿嘧啶缺陷型單倍體菌株出發(fā),構(gòu)建了類(lèi)丙酮酸脫羧酶(YDL080C)基因缺失菌株和β-異丙基蘋(píng)果酸脫氫酶(LEU2)基因缺失菌株。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,YDL080C基因缺失,異戊醇的含量無(wú)明顯變化;另一方面,LEU2基因缺失,異戊醇的含量降低16.16%。初步認(rèn)為異戊醇前體物α-酮異己酸由亮氨酸轉(zhuǎn)氨脫羧和糖代謝兩條途徑生成,其中前者可能是主要來(lái)源;α-酮異己酸代謝生成異戊醇途徑中,類(lèi)丙酮酸脫羧酶不是該途徑關(guān)鍵酶,推測(cè)其同工酶丙酮酸脫羧酶(PDC)可能是關(guān)鍵酶。下一步將對(duì)氨基酸轉(zhuǎn)氨途徑中編碼PDC的基因進(jìn)行研究,從而進(jìn)一步揭示工業(yè)黃酒酵母中異戊醇的合成機(jī)制,為構(gòu)建低產(chǎn)高級(jí)醇黃酒酵母工程菌奠定基礎(chǔ)。

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Effect of YDL080C and LEU2 gene knockout on isoamyl alcohol production in industrial yellow rice wine yeast

LI Tong1,2,3,SUN Jun-yong1,2,3,WU Dian-hui1,2,3,LI Xiao-min1,2,3,XIE Guang-fa3,4,*,LU Jian1,2,3,5,*

(1. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;3. School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China; 4.National Engineering Research Center for Chinese Rice Wine,China ShaoxingRice Wine Group Co.,Ltd,Shaoxing 312000,China;5. Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian,Suqian 223800,China)

The production of isoamyl alcohol,was studied in industrial rice wine yeast N85 with the method of gene knockout. Disruption cassette of “ YDL080C-URA3-YDL080C ” and “ LEU2-URA3-LEU2 ” were constructed using fusion PCR,and then electro-transformed into the Δura3 haploid yeast strain(MATa ura3),respectively. Finally the engineered haploids Na-y and Na-l were obtained. Lab-scale fermentation of yellow rice wine was preceded with Na-y and Na-l,respectively. The results showed that the concentration of isoamyl alcohol was almost invariable between the engineered strain Na-y and the parental haploid. On the contrary,the content of isoamyl alcohol was reduced by 16.16% with the engineered strain Na-l. There was no difference in physical and chemical indexes between the engineered strain and parental strain.

isoamyl alcohol;industrial rice wine Saccharomyces cerevisiae;YDL080C gene;LEU2 gene;gene knockout

2014-10-08

李童(1991-)，男，碩士研究生，主要從事釀酒方面的研究，E-mail:litong0201@gmail.com。

*通訊作者:謝廣發(fā)(1969-),男，碩士，教授級(jí)高工，主要從事黃酒的研究，E-mail:xiegf632@126.com。 陸健(1968-)，男，博士，教授，主要從事釀造酒、飼料方面的研究，E-mail:jlu@jiangnan.edu.cn。

食品加工過(guò)程安全控制的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，973項(xiàng)目(2012CB720802)；工業(yè)生物過(guò)程高效轉(zhuǎn)化與系統(tǒng)集成的科學(xué)基礎(chǔ)研究，973項(xiàng)目(2013CB733602)；安全食品精深加工科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)(2012B091400030)；食品發(fā)酵過(guò)程釀酒酵母氮代謝物阻遏效應(yīng)形成機(jī)制及其調(diào)控，國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(31130043)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目；高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智計(jì)劃(111計(jì)劃)資助項(xiàng)目(111-2-06)；江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(KLIB-KF201308)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)15-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.15.032