張喜納，趙錦慧

（周口師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口466001）

細(xì)胞膜位于細(xì)胞的最外層這一特殊位置，不僅為細(xì)胞提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境，并且細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的運輸、信號的傳導(dǎo)以及能量的傳遞都有密切的聯(lián)系，這就決定了對細(xì)胞膜通透性的認(rèn)識是對整個細(xì)胞乃至生命體認(rèn)識的基礎(chǔ)[1].細(xì)胞的生理活動與細(xì)胞膜的通透性息息相關(guān)，同時，細(xì)胞膜的通透性也能反映細(xì)胞所處的生理狀態(tài).通過對細(xì)胞膜通透性大小的研究，人們能夠更好地了解生命體的各種生理狀態(tài)，從而弄清相關(guān)疾病的發(fā)病機理，最終生產(chǎn)出更好的藥物來治療疾病[2－3].另外，通過對細(xì)胞膜通透性改變的研究，實現(xiàn)了細(xì)胞代謝的人工調(diào)控.此外，細(xì)胞膜通透性的研究對發(fā)酵工業(yè)也具有十分重要的意義[4].筆者以兔和雞血紅細(xì)胞膜為材料，研究不同因素對細(xì)胞膜通透性的影響，以期為相關(guān)方面的研究提供科學(xué)的依據(jù).

1 材料、器具與方法

1.1 材料

雞血和兔血，購于周口市農(nóng)貿(mào)市場.蒸餾水、葡萄糖、檸檬酸鈉、檸檬酸、氯化鈉、醋酸銨、草酸銨、硫酸鈉、無水乙醇等，由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院提供.

1.2 器具

高壓蒸汽滅菌鍋、離心機、電子天平、移液管、計時秒表、試管、容量瓶、燒杯、試管架等，由周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院提供.

1.3 方法

1.3.1 抗凝劑阿氏液的制備

分別稱取葡萄糖20.5g、檸檬酸鈉80g、檸檬酸0.55g、氯化鈉4.2g，溶解后定容至1 000mL，用檸檬酸鈉調(diào)節(jié)pH到6.1，115℃下滅菌10min后放入4 ℃冰箱保存，備用[5－6].

1.3.2 抗凝雞血及兔血的制備

取2個250mL的燒杯，分別加入100mL的阿氏液，并分別標(biāo)記為抗凝雞血和抗凝兔血，然后按5∶1的體積比分別加入20mL的新鮮雞血和兔血，得到120mL的抗凝雞血和兔血[7－8].

1.3.3 0.75%及0.9%的生理鹽水的制備

0.75%的兔血生理鹽水:稱取氯化鈉0.75g，溶解后，倒入100mL的容量瓶中，最后加入蒸餾水定容到100mL，然后貼上寫有兔血生理鹽水的標(biāo)簽.

0.9%的雞血生理鹽水:稱取氯化鈉0.90g，溶解后，倒入100mL的容量瓶中，最后加入蒸餾水定容到100mL，然后貼上寫有雞血生理鹽水的標(biāo)簽.

1.3.4 10%的抗凝雞及兔血紅細(xì)胞懸浮液的制備

抗凝雞血紅細(xì)胞懸浮液的制備:用移液管分別量取4mL抗凝雞血于6個刻度離心管中，2 000 r/min離心10min，棄上清，取沉淀；分別在所得的沉淀中加入適量0.9%的雞血生理鹽水，輕輕搖勻，制成懸浮液，2 000r/min再離心10min，取沉淀；重復(fù)上述操作，得到壓積雞血紅細(xì)胞；將壓積雞血紅細(xì)胞按照1∶9的體積比加入0.9%的雞血生理鹽水，制得10%的抗凝雞血紅細(xì)胞懸液[9].

抗凝兔血紅細(xì)胞懸浮液的制備:用移液管分別量取4mL抗凝兔血于6個刻度離心管內(nèi)，2 000 r/min離心10min，棄上清，取沉淀；分別在所得的沉淀中加入適量0.75%的兔血生理鹽水，輕輕搖勻，制成懸浮液，2 000r/min再離心10min，取沉淀；重復(fù)上述操作，得到壓積兔血紅細(xì)胞；將壓積兔血紅細(xì)胞按照1∶9的體積比加入0.9%的兔血生理鹽水，制得10%的抗凝兔血紅細(xì)胞懸液[9].

1.3.5 等滲溶液的制備

取7個燒杯和7個100mL容量瓶，將燒杯和容量瓶依次標(biāo)記為氯化鈉、氯化銨、醋酸銨、硝酸鈉、草酸銨、硫酸鈉、葡萄糖，然后依次稱取氯化鈉0.99g、氯化銨0.91g、醋酸銨1.31g、硝酸鈉1.45 g、草酸銨1.70g、硫酸鈉1.70g、葡萄糖5.76g，放入貼有對應(yīng)標(biāo)記的燒杯中，各自溶解后，分別倒入標(biāo)記好的相應(yīng)的容量瓶中，再分別用蒸餾水定容至100mL.

另取3個100mL容量瓶，并依次標(biāo)記為甘油、乙醇、丙酮，然后依次量取甘油2.33mL、乙醇1.86mL、丙酮2.38mL于標(biāo)記好的容量瓶中，再分別用蒸餾水定容至100mL.

1.3.6 溶血現(xiàn)象的觀察

先取試管2支，分別標(biāo)記為雞血和兔血，再向2支試管中各加入3mL蒸餾水，最后再分別加入1mL的抗凝雞和兔血紅細(xì)胞懸浮液，輕輕晃動試管搖勻，注意觀察是否發(fā)生溶血現(xiàn)象，如果發(fā)生溶血現(xiàn)象，則記錄溶血時間.

同樣地，其他10種溶質(zhì)分子的等滲溶液也分別按照上述蒸餾水的操作方法來進行，觀察是否發(fā)生溶血現(xiàn)象，如果發(fā)生溶血現(xiàn)象，則記錄溶血時間.實驗設(shè)3次重復(fù)，溶血時間取平均值.

2 結(jié)果與分析

不同溶質(zhì)分子滲入紅細(xì)胞的速度有所不同，因此不同的溶質(zhì)分子引發(fā)紅細(xì)胞產(chǎn)生溶血現(xiàn)象的時間不同，可以用紅細(xì)胞發(fā)生溶血的時間來估算不同溶質(zhì)分子對細(xì)胞膜通透性的影響程度[10]，實驗得到的溶血時間如表1所示.

表1 各類等滲溶液中紅細(xì)胞的溶血時間

根據(jù)表1溶血時間可知，相對于雞血紅細(xì)胞而言，兔血紅細(xì)胞更易發(fā)生溶血現(xiàn)象.

表2 脂溶性物質(zhì)與兔血紅細(xì)胞溶血時間的關(guān)系

表3 水溶性物質(zhì)與兔血紅細(xì)胞溶血時間的關(guān)系

根據(jù)溶質(zhì)的溶解性不同，可以把溶質(zhì)分為兩大類:脂溶性溶質(zhì)與水溶性溶質(zhì).根據(jù)實驗結(jié)果（見表2、表3）可知，相對于水溶性溶質(zhì)而言，脂溶性溶質(zhì)更容易使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血，即細(xì)胞膜對脂溶性溶質(zhì)的通透性較大.

表4 鈉鹽與兔血紅細(xì)胞溶血時間的關(guān)系

表5 銨鹽與兔血紅細(xì)胞溶血時間的關(guān)系

表4、表5實驗結(jié)果顯示:相對于鈉鹽來講，銨鹽則更易使紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象.此外，在銨鹽中，不同的銨鹽促使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血的時間也不同.

3 討論

實驗結(jié)果顯示，兔血紅細(xì)胞比雞血紅細(xì)胞更易發(fā)生溶血現(xiàn)象，脂溶性溶質(zhì)比水溶性溶質(zhì)更易使血紅細(xì)胞發(fā)生溶血，弱電解質(zhì)比強電解質(zhì)更易使血紅細(xì)胞發(fā)生溶血.總之，溶血現(xiàn)象是由多種因素共同決定的，不僅與血紅細(xì)胞來源有關(guān)，與溶質(zhì)種類和性質(zhì)也有關(guān).

兔血紅細(xì)胞之所以比雞血紅細(xì)胞更易發(fā)生溶血現(xiàn)象，可能是由于兔血紅細(xì)胞膜機械強度小，抗壓能力弱；而雞血紅細(xì)胞膜機械強度大，抗壓能力強.當(dāng)水分子進入雞血紅細(xì)胞時，雖然雞血紅細(xì)胞會出現(xiàn)吸水膨脹，但不會出現(xiàn)像兔血紅細(xì)胞一樣在短時間內(nèi)發(fā)生細(xì)胞溶血的現(xiàn)象.

脂溶性溶質(zhì)之所以比水溶性溶質(zhì)更容易使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血，其原因主要是，脂溶性物質(zhì)的化學(xué)成分與細(xì)胞膜的化學(xué)成分類似，而且這些脂溶性溶質(zhì)大多數(shù)屬于相對分子質(zhì)量較小的有機物.這些性質(zhì)都決定了脂溶性溶質(zhì)比水溶性溶質(zhì)更容易透過細(xì)胞膜，促使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象[11].

銨鹽之所以更易使紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象，其主要原因是，銨鹽屬于弱電解質(zhì)，在水溶液中銨鹽不完全解離，有電離平衡現(xiàn)象，銨根離子與水會發(fā)生可逆反應(yīng)生成氨分子，氨分子則可以順濃度梯度透過細(xì)胞膜，促使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象；而鈉鹽屬于強電解質(zhì)，在水溶液中不存在電離平衡現(xiàn)象，鈉離子是通過紅細(xì)胞膜上的鈉通道進入紅細(xì)胞的，由于離子通道介導(dǎo)的易化擴散是順電化學(xué)梯度的，氯化鈉等滲溶液則不會引起兔血紅細(xì)胞膜上鈉通道的開放，這也就決定了鈉鹽的等滲溶液不會促使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血[12－13].

不同的銨鹽促使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血的時間也不同，主要是因為銨鹽促使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血的原因是銨根離子在水溶液中存在電離平衡，因此銨根離子的濃度也就決定了兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血的時間長短.在等滲的氯化銨、醋酸銨和草酸銨溶液中，草酸銨等滲溶液中的銨根離子濃度是0.12 mol/L，相對低于氯化銨和醋酸銨等滲溶液中的銨根離子濃度（0.17mol/L），因此，氯化銨和醋酸銨比草酸銨更易使兔血紅細(xì)胞發(fā)生溶血現(xiàn)象[12－14].

[1]段學(xué)輝，葉勤，張嗣良，等.啤酒酵母的通透性對ATP生產(chǎn)活性的影響[J].華東理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2000，3（1）:33－36.

[2]章中.溫和壓力對酵母菌Saf細(xì)胞膜通透性的影響[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2007，20（2）:134－137.

[3]李永紅，朱登勇，王姣，等.酵母細(xì)胞通透性研究[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:理學(xué)版，2011，34（4）:34－39.

[4]魏娜，李柏林，歐杰，等.細(xì)胞膜通透性調(diào)節(jié)在發(fā)酵代謝中的重要性[J].食品科技，2006，19（9）:89－92.

[5]馬宗英.關(guān)于細(xì)胞膜對于不同物質(zhì)通透性差異的研究[D].東北師范大學(xué)，2013:3－6.

[6]羅立新.細(xì)胞融合技術(shù)與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2003:90－92 .

[7]劉曉艷，丘泰球，胡愛軍，等.幾種物理方法對細(xì)胞膜通透性的影響[J].生物技術(shù)，2002，46（2）:238－240.

[8]盧群，劉曉艷.超聲對酵母細(xì)胞膜通透性的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（9）:14－16.

[9]李研衍.生物工程[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1995:40－44.

[10]翟中和，王喜中，丁明孝，等.細(xì)胞生物學(xué)[M].北京:高等教育出版社，2008:31－43.

[11]楊漢民.細(xì)胞生物學(xué)實驗[M].北京:高等教育出版社，1997:109－110.

[12]孫穎，郝美璞.銨鹽通透細(xì)胞膜機理的探討[J].河北師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，1998，22（2）:264－266.

[13]馬超穎，石洪凌，陳超，等.細(xì)胞膜的滲透性實驗[J].唐山師范學(xué)院學(xué)報，2006，28（2）:27－28.

[14]Shi XH，Kong Y，Gao HJ.Coarse grained molecular dynamics and theoretical studies of carbon nanotubs entering cell membrane[J].Acta Mech Sin，2008，24:161－169.