鄢 碩，何 葉，林 彬，曹 磊，茍小軍，鄒 亮

(1.成都大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院，四川 成都 610106;2.成都大學(xué) 藥食同源植物資源開發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106)

0 引 言

油橄欖屬木犀科喬木，系著名的油料兼果用樹種，研究發(fā)現(xiàn)，油橄欖果中含有大量的多酚類物質(zhì)，尤其是齊墩果甙、羥基酪醇在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究中均表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗氧化活性，因此油橄欖果具有開發(fā)成含有抗氧化性效用的功能性食品潛力［1－3］.而將油橄欖作為功能性食品開發(fā)之前，需要了解其基本的安全性，但目前國(guó)內(nèi)尚無油橄欖果汁安全性的數(shù)據(jù).據(jù)此，本研究利用最大耐受劑量法評(píng)估了油橄欖果汁濃縮物的急性毒性，同時(shí)評(píng)價(jià)了其在急性和亞急性給藥條件下，對(duì)于小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響，并以此評(píng)估其對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材 料.

實(shí)驗(yàn)所用材料包括:油橄欖果汁凍干粉(本實(shí)驗(yàn)室制備)，甲醇、磷酸和氯化鈉均為分析純(成都科龍化工試劑廠)，羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)科學(xué)院植物研究所).

1.1.2 儀 器.

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括:JE25C21 型美的傳統(tǒng)榨汁機(jī)(廣東美的公司)，GL-21M 型高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，F(xiàn)D-IC-55 型冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，L-2000 高效液相色譜儀(日立公司)，TM-Vision 行為分析系統(tǒng)(成都泰盟公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為SPF 級(jí)KM 小鼠25 ±2 g(達(dá)碩生物科技公司).動(dòng)物飼喂的環(huán)境:12 h 白—晝循環(huán)，23 ±2 ℃溫度，55% ±10%濕度控制，動(dòng)物可以自由攝取食物.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 油橄欖果汁的制備.

油橄欖果經(jīng)榨汁機(jī)榨汁后，于3 000 r/min，10 min 冷凍離心除去殘?jiān)?，?jīng)低溫濃縮，最后真空冷凍干燥得油橄欖果汁凍干粉.

1.3.2 羥基酪醇含量測(cè)定.

［4］的方法，利用HPLC 外標(biāo)法，以羥基酪醇作為活性成分參照，流動(dòng)相為，甲醇∶ 0.2%磷酸溶液=12∶ 88，C18 柱，檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm(DAD 檢測(cè)器).

1.3.3 油橄欖果汁的急性毒性試驗(yàn).

采用最大耐受劑量法，設(shè)10 ×103mg/kg 和生理鹽水組(Saline)，每組20 只KM 小鼠，雌雄各半.劑量設(shè)計(jì)的依據(jù)是1 ×103mg/mL 是果汁凍干粉能夠配置成的最大濃度，將受試物配制成1 ×103mg/mL 溶液，以10 mL/kg 于動(dòng)物空腹下一次性灌胃染毒.灌胃后觀察其中毒癥狀、體征，連續(xù)觀察7 d，判定毒性分類.

1.3.4 急性條件下對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響.

設(shè)10 ×103mg/kg 和生理鹽水組(Saline)，每組10 只雄性KM 小鼠.將受試物配制成1 ×103mg/mL溶液，以10 mL/kg，于動(dòng)物空腹下一次性灌胃.灌胃5 min 后，將KM 小鼠放置于TM-Vision 行為學(xué)系統(tǒng)-Open Field Test 模塊中10 min，軟件自動(dòng)記錄其運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離.分析兩組間的差異，以此來判斷提取物是否對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)有影響.

1.3.5 亞急性條件下對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響.

設(shè)10 ×103mg/kg 和生理鹽水組(Saline)，每組10 只雄性KM 小鼠.將受試物配制成1 ×103mg/mL溶液，以10 mL/kg，每天灌胃1 次連續(xù)7 d，最后一次給藥后24 h 后，將小鼠放置于TM-Vision 行為學(xué)系統(tǒng)-Open Field Test 模塊中10 min，軟件自動(dòng)記錄其運(yùn)動(dòng)時(shí)間和總運(yùn)動(dòng)距離，以此來判斷提取物是否對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)有影響.

1.3.6 統(tǒng)計(jì)和分析.

自發(fā)活動(dòng)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)都采用Mean ±SEM 形式表示.均值的組間差異采用one-way ANOVA 分析，post hoc 采用LSD 檢驗(yàn)，P ＜0.05 被規(guī)定為有顯著差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 油橄欖果汁中羥基酪醇的含量

羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，經(jīng)HPLC 外標(biāo)法測(cè)定，制備的油橄欖果果汁提取物的羥基酪醇含量純度為5 mg/g.

圖1 羥基酪醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 油橄欖果汁的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

油橄欖果汁急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如表1 所示.7 d觀察期結(jié)束，觀察未見染毒小鼠有明顯中毒癥狀，其自發(fā)活動(dòng)、刺激反射、攝食活動(dòng)均無明顯異常.

表1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油橄欖果汁對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性LD50＞10 ×103mg/kg.說明小鼠對(duì)油橄欖果汁在最大給藥量劑量下具有良好的耐受性.

2.3 急性條件下對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

利用開場(chǎng)試驗(yàn)評(píng)估在急性給藥條件下，油橄欖果汁對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響，結(jié)果如表2 所示.統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩組指標(biāo)均未出現(xiàn)差異.說明在急性條件下，最大劑量的油橄欖果汁不會(huì)顯著增加和減少小鼠的自發(fā)活動(dòng)，急性給藥條件下，油橄欖果汁沒有發(fā)現(xiàn)由于中樞興奮性作用和中樞鎮(zhèn)靜效應(yīng).

表2 急性條件下開場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果表(n=10)

2.4 亞急性條件下對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

利用開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估在亞急性給藥條件下，油橄欖果汁對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響結(jié)果如表3 所示.結(jié)果顯示兩組指標(biāo)均未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)水平差異.說明在亞急性條件下，最大劑量的油橄欖果汁不會(huì)顯著增加和減少小鼠的自發(fā)活動(dòng)，亞急性給藥條件下，油橄欖果汁沒有發(fā)現(xiàn)由于中樞興奮性作用和中樞鎮(zhèn)靜效應(yīng).

表3 亞急性條件下開場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果表(n=10)

3 結(jié) 論

為了評(píng)價(jià)油橄欖果汁的急性毒性，本研究采用最大耐受劑量法來評(píng)價(jià)油橄欖果汁對(duì)小鼠的急性毒性.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最大劑量下觀察未見染毒小鼠有明顯中毒癥狀，無小鼠死亡，說明油橄欖果汁對(duì)小鼠急性經(jīng)口毒性LD50＞10 ×103mg/kg，具有很好的耐受性.同時(shí)，本研究還評(píng)價(jià)了油橄欖果汁在急性和亞急性給藥條件下，對(duì)于小鼠的自發(fā)活動(dòng)的影響.結(jié)果表明，在急性和亞急性給藥條件下，給藥組在開場(chǎng)試驗(yàn)中的靜止時(shí)間、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離同生理鹽水組相比均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.說明油橄欖果汁在急性和亞急性條件下，對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)既不會(huì)有興奮刺激作用也沒有鎮(zhèn)靜效應(yīng).綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究未觀察到油橄欖果汁的急性毒性和安全毒理學(xué)副作用，表明油橄欖果汁具有較高的安全性，具備開發(fā)出有效功能性食品的潛力.

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