徐玉玲，譚 平，羅小偉，潘迎志，吳南軒，梁 悅，劉 濤

(1.成都大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;2.湖北省 秭歸縣人民醫(yī)院，湖北 秭歸 443600)

0 引 言

亞麻油渣為胡麻油籽經(jīng)過壓榨或提取其所含植物油后所得的油渣.研究發(fā)現(xiàn)，亞麻油渣中含有以亞麻木酚素為代表的具有生理活性的物質(zhì)，它對雌激素依賴性疾病與骨質(zhì)疏松等癥有預(yù)防作用，目前，亞麻木酚素已被開發(fā)制成藥品和保健品，同時也作為食品的添加劑［1－3］.亞麻木酚素為無色晶形，可溶于水、甲醇、含水乙醇和丙醇，易被酶水解，其提取方法有溶劑浸提法、回流提取法、微生物發(fā)酵法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等［4－5］.本研究主要對亞麻油渣的處理方式、亞麻木酚素的提取工藝及其分離純化方法進行了研究.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括:亞麻油渣(批號，20130617)，購于山西神池縣福淵土特產(chǎn)品開發(fā)有限公司;亞麻木酚素對照品(批號，20130617)，由中國食品藥品檢定研究所提供;AB-8 型大孔吸附樹脂，購于天津波鴻樹脂科技有限公司;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括:KQ-100 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)，RE-5205B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮生儀器廠)，P2302II 型高效液相色譜儀(大連依利特分析儀器有限公司生產(chǎn)).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實驗的色譜條件為:色譜柱，GS-120-5-C18-AP(4.6 nmID ×250 mm，5 mL);流動相為，乙腈和水(70∶ 30)，流速，1 mL/min，檢測波長，280 nm，進樣量10 μL，柱溫25 ℃.

2.2 對照品溶液的制備

取亞麻木酚素標準品10.00 mg，精密稱定，置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，制得對照品溶液，其HPLC 圖譜見圖1.

2.3 供試品溶液的制備

取亞麻油渣顆粒400 g，放于5 000 mL 蒸餾燒瓶中，加3 200 mL 濃度為70%的乙醇溶液，加熱回流提取2 h.濃縮提取液至適量，向濃縮液中加入2 mol/L的NaOH 溶液至pH 值為8，一段時間后，加入2 mol/L 硫酸溶液至pH 值為4，離心除沉淀，加入蒸餾水定容至800 mL，制得供試品溶液，其HPLC 圖譜見圖2.

2.4 線性關(guān)系實驗

精密吸取對照品溶液，2、4、6、8、10、12、14 μL分別進樣，在“2.1”項色譜條件下，測定峰面積，以峰面積Y 對進樣量X 進行線性回歸得亞麻木酚素線性回歸方程，y =368.53X－50.752，r =0.9997.結(jié)果表明，亞麻木酚素在1.86 ～13.02 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系.

2.5 測定法

精密量取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，計算.

圖1 亞麻木酚素對照品HPLC 圖譜

圖2 亞麻油渣樣品HPLC 圖譜

2.6 提取工藝研究

研究發(fā)現(xiàn)，亞麻油渣提取過程中的影響因素主要為乙醇濃度、加醇量、提取時間及提取次數(shù)4 個因素［6－8］，本實驗對此進行了研究.

2.6.1 單因素實驗的考察.

相關(guān)文獻中，選擇70%的乙醇溶液作為提取溶媒較多［6－8］，所以本實驗選擇乙醇濃度為60%、70%、80%，并在這3 個水平進行考察.實驗最終確定乙醇濃度為70%.

2.6.2 正交實驗因素水平確定.

以乙醇為提取溶媒，選取提取時間(A)、提取次數(shù)(B)、加醇倍數(shù)(C))為考察因素，以提取液中亞麻木酚素及固含物的量為考察指標，綜合加權(quán)評分，采用L9(34)正交表安排實驗，因素水平表見表1.

表1 提取工藝因素水平表

2.6.3 實驗方法與結(jié)果.

分別取9 組亞麻油渣藥材(每組100 g)，按照正交實驗安排表(表2)進行回流提取正交實驗，提取液含量測定方法按“2.5”項方法進行.結(jié)果如表2所示，方差分析如表3 所示.

表2 正交實驗安排及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析表

正交實驗結(jié)果表明，3 個因素對從亞麻油渣中木酚素提取效果影響順序從大到小分別為，提取次數(shù)＞加醇倍數(shù)＞提取時間.方差分析表顯示，提取次數(shù)和加醇倍數(shù)對提取效果影響均顯著.綜合實驗結(jié)果，選取A1B3C3作為本提取工藝的最佳參數(shù)，即:藥材中加入16 倍量70%乙醇，提取3 次，每次1 h.

2.6.4 提取工藝驗證實驗.

取3 組亞麻油渣顆粒物，1、2 組100 g，3 組200 g，1、2 組加入1 600 mL 70%的乙醇，3 組入3 200 mL 70%的乙醇分別提取3 次，每次1 h，合并提取液，測定提取液中木酚素的含量，結(jié)果如表4 所示.

表4 提取工藝驗證結(jié)果表

驗證實驗結(jié)果表明，本提取工藝穩(wěn)定、可行.

3 亞麻木酚素的分離純化研究

3.1 樹脂優(yōu)選實驗

為對樹脂進行優(yōu)選，本實驗取處理好的HPD100、D101、AB-8、HPD300、HPD600 型大孔樹脂各7 g 于100 mL 燒杯中，用移液管移取經(jīng)離心處理的樣品液各50 mL 于各型號大孔樹脂中進行吸附，隔10 min、30 min、1 h、2 h 各震蕩一次，靜置24 h.取適量上清液，測定各樹脂吸附亞麻木酚素的含量，測定結(jié)果如表5 所示，計算公式為，

表5 不同類型樹脂對亞麻木酚素的吸附率

表5 結(jié)果表明，AB-8 型大孔樹脂對亞麻木酚素的吸附能力最好.

3.2 上樣量

取預(yù)處理好的20 g AB-8 型大孔樹脂裝入內(nèi)徑1.6 cm，長30 cm 的玻璃層析柱中，用純凈水洗至無醇味.加入離心處理的樣品溶液80 mL 以2 BV/h 流速上樣，控制流出液流速3 BV/h ，每5 mL 收集一次流出液，總共收集10 份，結(jié)果如圖3 所示.

圖3 AB-8 型樹脂吸附亞麻木酚素的保留率

從圖3 可看出，當亞麻木酚素提取液的上樣體積加至45 mL 時(9 份)，AB-8 型大孔樹脂吸附亞麻木酚素的保留率開始低于95%，可認為AB-8 型大孔樹脂柱開始出現(xiàn)泄漏，故初步確定樹脂的上樣量為45 mL.計算出單位AB-8 型大孔樹脂吸附量為3.40 mg/g.

3.3 洗脫溶劑選擇

稱取5 組預(yù)處理好的20 g AB-8 型大孔樹脂，分別裝入內(nèi)徑2.8 cm，長30 cm 的5 支同規(guī)格的玻璃層析柱中，用純凈水洗至無醇味，加入離心處理的樣品液45 mL 上樣吸附.充分吸附后，用純凈水洗至流出液無色，再分別用10%、20%、30%、40%、50%、的乙醇溶液100 mL 洗脫，并收集各流出液，解吸率結(jié)果如表6 所示，其計算公式為，

表6 不同濃度溶劑洗脫下AB-8 型樹脂對亞麻木酚素的解吸率

表6 結(jié)果表明，30%的乙醇溶液洗脫能力最強.

3.4 洗脫溶劑用量

稱取預(yù)處理好的20 g AB-8 型大孔樹脂，裝入內(nèi)徑1.6 cm，長30 cm 的玻璃層析柱中，用純凈水洗至無醇味，加入離心處理的樣品液45 mL 上樣吸附.充分吸附后，用純凈水洗至流出液無色，再用體積分數(shù)為30%的乙醇溶液洗脫，每45 mL 收集一次洗脫液，收集7 次，結(jié)果如圖4 所示.

圖4 不同倍數(shù)乙醇對吸附在AB-8 型樹脂上亞麻木酚素的解吸率

圖4 結(jié)果表明，6 BV 的乙醇溶液能對AB-8 型大孔樹脂吸附的亞麻木酚素能完全洗脫，其單位AB-8 型大孔樹脂吸附量為3.44 mg/g.

3.5 純化工藝驗證

取3 組處理好的AB-8 型大孔樹脂，1、2 組20 g，分別裝入內(nèi)徑1.6 cm，長30 cm 的2 支同規(guī)格玻璃層析柱中(徑高比1.6∶ 16)，3 組40 g，裝入內(nèi)徑2.6 cm，長20 cm 的玻璃層析柱中(徑高比2.6∶ 20)，用純凈水洗至無醇味，1、2 組加入離心處理的樣品液45 mL，3 組加入離心處理的樣品液90 mL，采用2 BV/h 流速上樣，6 BV 的30%乙醇，3 BV/h 洗脫，收集各組洗脫液，測定洗脫液中木酚素的含量，結(jié)果如表7 所示.

表7 純化工藝驗證結(jié)果表

驗證實驗結(jié)果表明，本純化工藝穩(wěn)定、可行.

4 結(jié)論與討論

1)通過正交試驗對亞麻木酚素的提取工藝條件進行了優(yōu)化，得到的最佳工藝為:用體積分數(shù)為70%乙醇，料液比1∶ 16，提取3 次，每次1 h.樹脂優(yōu)化實驗結(jié)果表明:AB-8 型大孔樹脂最適合分離純化亞麻油渣提取物.對上樣量的研究、洗脫溶劑選擇研究、洗脫溶劑用量研究的優(yōu)化，得到的最佳純化工藝為:2 BV/h 流速上樣，6 BV 的30%乙醇，3 BV/h洗脫.

2)查閱相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，大孔樹脂的洗脫流速在1 ～5 BV/h 之間變化，對樣品的洗脫影響不大［9－11］.考慮到工作效率，本實驗選擇洗脫流速為3 BV/h 的AB-8 型大孔吸附樹脂對樣品分離純化后可重復(fù)使用，提高了工藝安全性和經(jīng)濟性.

3)目前國內(nèi)外報道用亞麻油渣提取制備亞麻木酚素的工藝研究較少，實驗所選原藥材經(jīng)過提取后的亞麻油渣仍可作家畜的飼料使用，大大地提高了亞麻油渣的綜合利用價值.本研究提取工藝簡單，提取溶媒價廉，不采用有機溶媒萃取，不會對環(huán)境造成污染，生產(chǎn)成本低，回收后的乙醇仍可以重復(fù)使用，極大地降低了生產(chǎn)成本.

4)本實驗對溶劑浸提法、回流提取法進行了研究.實驗結(jié)果表明，回流提取方法更佳，而且回流法提取工藝具有提取周期短，操作便捷，提取效率高，所用溶劑少等優(yōu)點，故本次實驗選取回流法提取工藝.另外，由于亞麻油渣呈顆粒狀，研究表明，對其進行粉碎對實驗結(jié)果有一定影響，但顆粒大小對提取效果影響不大.

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