王琨 馬治敏 常超 王學東 伍金娥

摘要：研究了布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）對腸道菌群失調櫻桃谷肉鴨腸道酶的修復作用。將25只櫻桃谷肉鴨隨機分成正常對照組（5只）、抗生素組（20只）。建立櫻桃谷肉鴨菌群失調模型，菌群失調模型建立后，抗生素組分為4組，每組5只：即氨芐青霉素組，布拉迪酵母菌低劑量組（試驗Ⅰ組）、中劑量組（試驗Ⅱ組）、高劑量組（試驗Ⅲ組），其中，氨芐青霉素組立即屠宰取樣并測定相關指標，各劑量布拉迪酵母菌組按每天200 mL/只飼喂各劑量酵母菌菌懸液，正常對照組自由飲水，各組連續(xù)飲用15 d。觀察各組腸黏膜酶活性和基因表達的變化。結果表明，布拉迪酵母菌具有調節(jié)和增強雙糖酶的活性、營養(yǎng)物質的吸收能力，對肉鴨黏膜蛋白質含量無顯著影響。

關鍵詞：布拉迪酵母菌（Saccharomyces boulardii）；菌群失調；黏膜酶活；基因表達

中圖分類號：S834 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2690-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.035

Effect of Saccharomyces boulardii on Intestinal Enzyme Activity of

Meat Ducks with Intestinal Dysbacteriosis

WANG Kun，MA Zhi-min，CHANG Chao，WANG Xue-dong，WU Jin-e

（College of Food Science and Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023， China）

Abstract：The experiment aimed at studying the repair effect on intestinal dysbacteriosis ducks by Saccharomyces boulardii. 25 Cherry valley ducks were randomly divided to 5 groups such as normal control group， four test groups which need construct intestinal dysbacteriosis model first for 10 days. After the dysbacteriosis model constructed the four groups were treated with ampicillin and different doses of Saccharomyces boulardii 200 mL per duck for 15 d. The ampicillin group were slaughtered after treatment and tested correlative index， and the Saccharomyces boulardii groups were observed about intestinal enzyme activity and gene expression. The results showed that Saccharomyces boulardii could moderate and enhance the activity of disaccharidase and absorption of nutrients， and had no significant effect on the intestinal mucosa protein of meat duck.

Key words： Saccharomyces boulardii；dysbacteriosis； mucosa enzyme activity；gene expression

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，長期大量濫用抗生素導致畜禽腸道結構發(fā)生了改變，并且影響動物的免疫機能，應用微生態(tài)制劑代替獸藥改善動物腸道結構一直是畜牧研究學者關注的焦點。

正常情況下，腸道菌群具有特定的定性、定位和定量結構，種群間處于一種有利于機體健康的動態(tài)平衡狀態(tài)。但當這些正常的微生物菌群受到宿主生理狀況及飲食、藥物等的影響時，腸道正常菌群在種類、數(shù)量和比例上發(fā)生異常的變化，偏離正常的生理狀態(tài)，轉變?yōu)椴±硇越M合狀態(tài)，即菌群失調[1]，臨床上以腹瀉為明顯癥狀[2]。腸道菌群紊亂廣泛存在于動物生產實踐和臨床醫(yī)學實踐中，腸道菌群失調將直接破壞腸道機械屏障，通過維護調整腸道微生態(tài)，對于維持腸道黏膜屏障完整結構和正常消化吸收功能無疑具有重要的意義。布拉迪酵母菌在腸道修復中有著重要的作用，布拉迪酵母菌與腸道黏膜相互作用，能防止病原體入侵，調節(jié)宿主免疫應答，減少炎癥物質分泌，抑制細菌毒素作用并且加強小腸黏膜刷毛緣酶活性增強營養(yǎng)物質的運輸[3]。本試驗以添加氨芐青霉素造成肉鴨腸道菌群紊亂模型的肉鴨為研究對象，通過在飲水中用不同劑量的布拉迪酵母菌調節(jié)菌群紊亂肉鴨，測定肉鴨腸黏膜酶活性和腸黏膜蛋白質、DNA以及RNA含量，為該微生態(tài)制劑的推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品與日糧

氨芐青霉素購自武漢市華順生物技術有限責任公司；布拉迪酵母菌由法國百科大制藥廠生產，試驗用布拉迪酵母菌菌懸液108 CFU/L、109 CFU/L、1010 CFU/L。飼料配方見表1所示。

1.2 儀器與試劑

測定儀器：GHP-9050型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、YM50型全自動電熱立式消毒器、全自動生化分析儀、WFJ7200型可見分光光度計、SPV-2000型紫外可見分光光度計、HH-恒溫水浴鍋、IKA ULTRRAX-UT TD C（SO）型勻漿器等。

試劑盒：ATP酶測試盒、二糖酶（蔗糖酶、麥芽糖酶）測試盒、蛋白質定量測試試劑盒，購自南京建成科技有限公司。

其他：高氯酸，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗動物與設計

櫻桃谷肉鴨（1日齡），購自武漢市春江禽業(yè)有限責任公司。將25只櫻桃谷肉鴨隨機分為對照組（5只）、抗生素組（20只）。櫻桃谷肉鴨菌群失調模型的建立需要10 d，具體參見文獻[4]，菌群失調模型建立后，抗生素組分為4組，每組5只：即氨芐青霉素組，低劑量組（試驗Ⅰ組）、中劑量組（試驗Ⅱ組）、高劑量布拉迪酵母菌組（試驗Ⅲ組），其中，氨芐青霉素組立即屠宰取樣并測定相關指標，其目的在于比較布拉迪酵母菌組與病理組間的區(qū)別以及布拉迪對病理黏膜的修復效果。各劑量布拉迪酵母菌組按每天200 mL/只飼喂各劑量酵母菌菌懸液，對照組自由飲水，各組連續(xù)飲用15 d。菌群失調模型成功建立后開始飼喂布拉氏酵母菌記為修復試驗的第一天。

1.4 飼養(yǎng)管理

按照常規(guī)肉鴨飼養(yǎng)方法，分0～3周齡和4～7周齡兩個時期飼養(yǎng)。試驗前將鴨舍及附屬設備用福爾馬林和高錳酸鉀溶液消毒，使門窗完好、排水通暢，通風保溫性能好。全期籠養(yǎng)，自由采食。

1.5 檢測指標及測定方法

1.5.1 腸黏膜酶活性的測定 修復試驗第16天屠宰試驗鴨，取試驗鴨的十二指腸、空腸、回腸，解剖各腸段，刮下腸黏膜，按照各種酶的測定方法的要求進行勻漿，測定酶活性。

1）ATP酶活性的測定：南京建成ATP酶測試盒測定（十二指腸、空腸、回腸腸黏膜等量混合物）。

2）二糖酶（蔗糖酶、麥芽糖酶）活性的測定：南京建成二糖酶測試盒（A082-3）測定（十二指腸、空腸、回腸腸黏膜等量混合物）。

1.5.2 腸上皮細胞基因表達的測定

1）黏膜中蛋白質含量的測定：南京建成蛋白質定量測試試劑盒測定（十二指腸、空腸、回腸腸黏膜等量混合物）。

2）DNA、RNA含量的測定，按文獻[5]進行操作，步驟如下：①取2 mL 1%黏膜勻漿上清液，加入1 mL 0.6 moL/L的冷高氯酸中混勻；②冰上靜置10 min，充分溶解其樣本中蛋白質，500 r/min離心10 min，棄上清液；③再用2 mL 0.2 mol/L的冷高氯酸洗滌2次，揮發(fā)余酸；加入2 mL 0.3 mol/L的氫氧化鉀，37 ℃下孵育60 min；④加入1 mL 1.2 mol/L的冷高氯酸，冰上靜置10 min，500 r/min離心15 min，收集此上清液a；⑤沉淀物再用2 mL 0.2 mol/L的冷高氯酸洗滌1次，再次離心收集上清液b，混合兩次上清液，用于RNA濃度的測定； ⑥將分離的RNA溶液于260 nm和232 nm波長下測定各管吸光度。

計算RNA含量采用以下公式：

CRNA（μg/mL）=（3.4×OD260 nm-1.44×OD232 nm）/0.068

上述公式所得的結果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得到原樣品的RNA濃度，結果以mg/g表示。

在以上步驟所剩余沉淀物中加入4 mL 1 mol/L的冷高氯酸，沸水浴中加熱10 min，500 g，離心20 min，除去變性蛋白，取上清液于260 nm、280 nm和320 nm，1 cm光徑，用1 mol/L的冷高氯酸調零，測各管吸光度。

計算DNA含量采用以下公式：

CDNA（μg/mL）=（OD260 nm-OD320 nm）×62.9-（OD280 nm-OD320 nm）×36.0

上述公式所得的結果再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即得到原樣品的DNA濃度，結果以mg/g表示。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用EXCEL進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS17.0軟件中的平衡試驗設計方差分析過程進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，均值的多重比較采用Duncans法和LSD法，結果采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜ATP酶活性的影響

由表2可知，各組之間ATP酶活性的影響差異不顯著（P>0.05）。試驗組Na+-K+-ATP酶活性與對照組相比無顯著差異（P>0.05），各試驗組與氨芐青霉素組相比均有提高。Mg2+-ATP酶活性各組之間差異不顯著（P>0.05）。Ca2+-ATP酶活性的研究結果顯示，氨芐青霉素誘導的肉鴨腹瀉模型中的Ca2+-ATP酶活力相對正常對照組下降，試驗Ⅰ組酶活性有所上升；試驗Ⅱ組酶活力上升明顯，但差異不顯著，試驗Ⅲ組的Ca2+-ATP酶活與對照組相比提高了13.39%（P>0.05）。Mg2+-Ca2+-ATP酶活力與對照組、氨芐青霉素組相比均無顯著差異。

2.2 布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜雙糖酶活性的影響

雙糖酶位于小腸黏膜紋狀緣上，是重要的糖類消化酶，雙糖酶的缺乏或活性降低均可引起雙糖分子在腸道內水解減少，出現(xiàn)吸收障礙、腹瀉、消化不良等癥狀。繼發(fā)感染性腹瀉引起小腸黏膜受損后，導致雙糖酶活性下降。本研究中選取蔗糖酶和麥芽糖酶為對象，考察給菌群失調的肉鴨自由飲用不同劑量的布拉迪酵母菌對雙糖酶活性的影響。

由表4可知，與對照組相比，氨芐青霉素組與飼喂布拉迪酵母菌組的蔗糖酶活性均降低，表明抗生素導致的腹瀉可繼發(fā)雙糖酶活性下降。但是飼喂布拉迪酵母菌組之間與氨芐青霉素組相比，并未表現(xiàn)出顯著的劑量依賴關系，低、高劑量組的蔗糖酶活性顯著上升（P<0.05），中劑量組酶活上升程度緩慢；麥芽糖酶表現(xiàn)出顯著的劑量依賴關系，高劑量組酶活最高，可達30.50±2.07 U/（mg·prot）。據(jù)研究表明，雙糖酶活性與十二指腸黏膜的絨毛萎縮程度有相關性[6]，提示布拉迪酵母菌組具有調節(jié)絨毛形態(tài)均正常，增加雙糖酶活性。人類志愿者和試驗小鼠通過口服冷凍干燥制備的布拉迪酵母菌，在腸道內能產生積極的效果，包括增加營養(yǎng)吸收和腸道蠕動、增加蔗糖酶、麥芽糖、糖化酶、乳糖、海藻糖、氨基肽酶、堿性磷酸酶在腸道上皮細胞及腔內液中的含量，提高和加強sIgA分泌合成受體[7]。從本試驗結果來看，布拉迪酵母菌具有調節(jié)和增強雙糖酶的活性。

2.3 布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜細胞蛋白質含量及基因表達的影響

2.3.1 布拉迪酵母菌對黏膜中蛋白質含量的影響 由于上述幾種酶位于小腸細胞內，因此通過對黏膜中總蛋白質含量來間接反映總酶含量與上皮黏膜細胞中的蛋白質含量。布拉迪酵母菌對肉鴨腸道黏膜蛋白質含量的影響見表4。由表4可知，試驗Ⅱ組腸道黏膜蛋白質含量最大即4.55 mg/mL，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組與氨芐青霉素組相比分別提高了3.49%（P>0.05）、32.27%（P<0.05）、11.34%（P>0.05），由此可以得到，酵母菌可以提高腸道黏膜中蛋白質的含量。

2.3.2 布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜DNA、RNA含量的影響 RNA的含量與蛋白質的合成代謝直接有關，RNA/DNA的增加，表明合成蛋白質能力增強，生長速度越快，試驗Ⅱ組RNA/DNA最大，合成蛋白質能力最強。布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜DNA、RNA含量的影響見圖1。由圖1可知，試驗Ⅱ組提高量最為顯著；與對照組相比，試驗Ⅱ組提高了肉鴨腸道黏膜的DNA的含量，表明其有促進腸黏膜細胞增殖的作用。

3 討論

3.1 布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜酶活性的影響

小腸在食物消化吸收過程中占主導地位，小腸消化主要包括腸腔消化和黏膜消化，腸上皮的微絨毛上存在黏膜消化的酶類，這些酶能促進營養(yǎng)物質的吸收[8]。小腸黏膜中存在十二指腸腺和小腸腺[9]。日糧中的碳水化合物主要由多糖、寡糖、二糖和單糖組成，其中單糖可被直接吸入體內，二糖則不能被小腸直接吸收。小腸黏膜上的二糖酶能將二糖水解成單糖后被機體吸收利用，由此可見，在碳水化合物的吸收利用中，小腸黏膜二糖酶有著極其重要的作用[10]。Buts等[11]研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠近回腸段切除后，連續(xù)8 d灌喂布拉迪酵母菌，橫斷組切除黏膜增生并顯著減少了蔗糖酶、乳糖酶和麥芽糖酶的活性；與橫斷組相比，布拉迪酵母菌組沒有影響?zhàn)つぴ錾黾与p糖酶的活性。ATP酶是組織細胞和細胞器的膜上的一種蛋白酶，在物質運輸、能量轉換以及信息傳遞方面有著極其重要的作用。有報道，釀酒酵母菌能夠使細胞質中的Na+和K+含量維持在正常的使用范圍內，包括血漿膜中的H+-ATP酶、Na+-ATP酶、Na+/H+逆向轉運蛋白、K+（Na+）轉運蛋白[12]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性的大小則是反應能量代謝和功能有無損傷的一個重要標志[13]，與電解質和水的吸收有關。小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活性的高低反映小腸對營養(yǎng)物質的吸收能力，該酶活力減少時，腸道對氨基酸、葡萄糖、Na+等營養(yǎng)物質的吸收減少，排除增多。小腸對糖和蛋白質的吸收與鈉吸收偶聯(lián)，鈉泵分解ATP產生的能量以維持鈉和鉀的濃度[11]。本試驗結果表明，酵母菌組修復菌群失調肉鴨后，對ATP酶活性無顯著影響，氨芐青霉素組對營養(yǎng)物質的吸收能力減弱，酵母菌提高了肉鴨對營養(yǎng)物質的吸收能力。由酵母菌對菌群失調肉鴨的調整作用可見，酵母菌使肉鴨腸黏膜上蔗糖酶活性降低。中、高劑量布拉迪酵母菌組與對照組相比提高了麥芽糖酶活性，酵母菌可以提高肉鴨對麥芽糖的吸收能力。

3.2 布拉迪酵母菌對肉鴨腸黏膜細胞蛋白及基因表達的影響

腸黏膜中DNA、RNA以及蛋白質的含量改變可以反映細胞功能和形態(tài)的改變。RNA含量的增加，通常是指蛋白質合成的增加，其一是黏膜內蛋白質增加，其二是參與機體黏膜內蛋白質黏膜合成過程中的蛋白酶的增加。黏膜內的DNA和RNA含量的降低表明動物腸黏膜細胞的增殖能力下降，損傷后修復過程減慢[14]。本研究中采用RNA/DNA的比值來評價酵母菌提高腸道黏膜蛋白質含量的趨勢，中劑量布拉迪酵母菌促進腸黏膜細胞增殖的作用。

對菌群失調肉鴨連續(xù)飼喂布拉迪酵母菌15 d，酵母菌提高了肉鴨對營養(yǎng)物質的吸收能力，并能在一定程度上提高腸黏膜上蔗糖酶、麥芽糖酶活性、各種ATP酶活性，中劑量組顯著提高黏膜中蛋白質含量，并能促進腸黏膜細胞增殖。布拉迪酵母菌對腸道菌群失調有一定的修復作用，其具體作用機制還需要進一步探討。

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