何勝 林美情 鄧曉珍 潘霖 鐘絹 寧梅 韋健全 張樹球

鐵皮石槲對高鋁飼養(yǎng)小鼠生化指標(biāo)的影響

何勝 林美情 鄧曉珍 潘霖 鐘絹 寧梅 韋健全 張樹球

目的 探討鐵皮石槲對高鋁飼養(yǎng)小鼠機(jī)體生化指標(biāo)的影響。方法 選用昆明種小鼠30只，分成正常組、模型組、治療組。除正常組外，用三氯化鋁拌飼料飼養(yǎng)小鼠4個月，到結(jié)束前3周治療組用鐵皮石槲水提液灌胃21d。用水迷宮方法測定實(shí)驗(yàn)前、中、后小鼠的記憶力,實(shí)驗(yàn)結(jié)束,取靜脈血待測；處死動物后,取大腦做成10%腦勻漿待用；測定乙酰膽堿酯酶(AchE)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、膽固醇(TC)、鋁（Al3+）含量等。結(jié)果 治療組、模型組和正常組，腦勻漿AchE依次為（0.59±0.16）、（0.85±0.09）、（0.62±0.13）U/mgprot，模型組與治療組、正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；腦勻漿鋁（Al3+）含量依次為（0.61±0.10）、（0.72±0.06）、（0.59±0.05)μg/mL，模型組與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；腦勻漿MDA含量依次為（2.80±0.52）、（4.51±1.29）、（3.21±1.48)nmol/mL，模型組顯著高于其他2組（P＜0.05）；y型水迷宮游水時間，模型組與正常組后期增加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；GSH-PX、TC各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 高鋁飼養(yǎng)小鼠腦勻漿和血清鋁含量、AchE活力、MDA含量明顯升高，鐵皮石槲灌服后有明顯改善。

鐵皮石槲；鋁；乙酰膽堿酯酶(AchE)

全球鋁的應(yīng)用極其廣泛,人們每天都在接觸鋁,除生活中常用的鋁制品外,企業(yè)的排放污染,如電解鋁廠等，排放大量的鋁和氟等各種元素。自從國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)患者大腦里沉積大量鋁以來，人們才開始注意到鋁與阿爾茨海默?。ˋlzheimer,AD）之間的關(guān)系，并提出AD的鋁中毒學(xué)說[1]，用鋁來復(fù)型AD模型,也有一定的相似性。老年癡呆癥（AD）是老年人中常見的疾病，臨床表現(xiàn)以認(rèn)知能力迅速減退和記憶功能喪失為特征，由于發(fā)病機(jī)理極其復(fù)雜，學(xué)術(shù)界提出了多種學(xué)說解釋發(fā)病機(jī)理,尚未闡明清楚，因而尚無根治藥物。而鋁與AD發(fā)病的直接關(guān)系尚缺證據(jù),因此,若揭示兩者間的直接關(guān)系,闡明發(fā)病機(jī)理,并通過排鋁來防治此病,具有重要的實(shí)際價值。李韜等[2]曾用鋁來復(fù)型AD模型，探討二者間的聯(lián)系, 但仍有許多問題不清楚,如沒有測定大腦中鋁的含量與乙酰膽堿酯酶活力之間是否存在內(nèi)在關(guān)系、膽堿能系統(tǒng)相應(yīng)的大腦細(xì)胞形態(tài)學(xué)是否有損害，尚需要進(jìn)一步深入探討。因此，本實(shí)驗(yàn)用氯化鋁拌飼料喂養(yǎng)小鼠從3個月延長至5個月復(fù)制AD模型，用中藥鐵皮石槲水提液[3]治療后，測定大腦、血清乙酰膽堿酯酶（AchE）等生化指標(biāo)和鋁含量、大腦病理檢查，特別檢查與記憶功能密切相關(guān)的膽堿能神經(jīng)中樞皮質(zhì)和海馬形態(tài)變化，綜合分析，探討鋁對該病的作用機(jī)理和評價治療效果,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 氯化鋁、國產(chǎn)分析純。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿酯酶(AchE)試劑盒、總膽固醇(TC)、甘油三酯（TG），分別購自四川成都邁克科技有限公司,凱基生物公司，南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物及分組 選用昆明種小鼠30只，右江民族醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)時提供，動物實(shí)驗(yàn)許可證SYXK桂2011-0010，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2012-0003。鼠齡3個月，雌雄各半。分成正常組、模型組、治療組。各鼠編號稱體質(zhì)量，分籠喂養(yǎng)，每籠5只，放獨(dú)立式鼠籠飼養(yǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)(廣東珠海市再鑫儀器有限公司產(chǎn)品),空氣過濾凈化,室溫空調(diào)26℃～28℃。均用右江民族醫(yī)學(xué)院動物室提供的混合飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)1個月,進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練,并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前水迷宮測試。

1.3 治療藥物 中藥鐵皮石槲(干藥材),由廣西玉林師范學(xué)院贈送。稱量,放藥鍋內(nèi)加熱水提取液-乙醇沉淀-去沉淀-回收乙醇，藥液定容為0.2g/mL生藥,分裝,高壓105℃，滅茵30min,取出冷卻放冰箱保存。

1.4 AD模型的建立 實(shí)驗(yàn)前1個月進(jìn)行水迷宮測試。第2個月開始造模,除正常組外，其余2組用16g/L濃度的

AlCl3水溶液，按每鼠1.5mL(24mg)/d，拌飼料6～9g/每鼠喂養(yǎng)(動物室提供的標(biāo)準(zhǔn)飼料)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，共120d（4個月）。自由飲用自來水。用水迷宮方法，測定造模前、后和治療后小鼠的記憶功能[2]。

1.5 治療方法 造模到100d后，治療組用鐵皮石槲藥液灌喂，劑量均為0.1mL/只，每天1次，用蒸餾水稀釋至0.2mL后灌喂，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（治療21d）。正常組和模型組用等量的蒸餾水代替，方法相同。

1.6 生化指標(biāo)的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，從小鼠眼球后靜脈取血

0.8 ～1.0mL，離心取血清待用。處死動物，取大腦，用生理鹽水洗去血液，并用濾紙吸干水分，稱質(zhì)重，在冰浴下用勻漿器勻漿，用生理鹽水稀釋成10%的勻漿，離心（3500r/min）10min，取上清液4℃冰箱保存?zhèn)溆?。測定腦勻漿乙酰膽堿酯酶（AchE）活力原理，AchE催化乙酰膽堿水解成膽堿和乙酸，膽堿可以與巰基顯色劑反應(yīng)生成TNB（對稱三硝基苯）黃色化合物，根據(jù)顏色深淺進(jìn)行比色定量，水解產(chǎn)物膽堿的數(shù)量可反映膽堿酯酶的活力。丙二醛(MDA)測定原理，用MDA與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,形成紅色產(chǎn)物,在532nm有最大吸收峰，比色測定；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定原理,利用GSH-PX催化過氧化氫(H2O2)與還原型谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)生成水（H2O）和氧化型谷胱甘肽(GS-SG),測定被消耗的還原型谷胱甘肽(GSH)的量來計(jì)算谷胱甘肽過氧化物酶的活力；血清TC（總膽固醇）測定，用

COD-CE-PAP法測定；血清TG用GPO-POD法測定；具體操作按試劑盒說明書。腦勻漿鋁含量測定，用原子吸收分光光度計(jì)測定（儀器，德國產(chǎn)，型號為：novAA400p，石墨爐）。水迷宮游水時間測定，利用y型水迷宮，開始預(yù)先訓(xùn)練5d，每天游水訓(xùn)練

3次，使其熟悉上岸地點(diǎn)（逃命），計(jì)算從下水到達(dá)上岸地點(diǎn)時間（s）和錯誤率。統(tǒng)計(jì)時把超過10s以上按10s計(jì)[4]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，兩兩比較采用

LSD方法檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦GSH-PX、MDA、Al3+測定結(jié)果 結(jié)果顯示,腦

GSH-PX各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MDA模型組顯著高于其他2組（P＜0.05）；Al3+模型組顯著高于正常組（P＜0.01）。見表1。

表1 腦GSH-PX、MDA、Al3+測定結(jié)果比較（x±s）

2.2 血清MDA、Al3+、TC測定結(jié)果 結(jié)果顯示,血清MDA模型組顯著高于其他2組（P＜0.05）；Al3+模型組顯著高于其他2組（P＜0.01）；TC各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 血清MDA、Al3+、TC比較（x±s）

2.3 腦、血清AchE、血清TG測定結(jié)果 結(jié)果顯示, 血清AchE正常組顯著低于治療組、模型組（P＜0.01）；腦AchE，模型組顯著高于治療組、正常組（P＜0.01）；血清TG各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 腦、血清AchE、血清TG比較（x±s）

2.4 實(shí)驗(yàn)前、中、后水迷宮測定結(jié)果 結(jié)果顯示，3組隨著實(shí)驗(yàn)時間延長，水迷宮時間模型組正常組也顯著增加，但治療組增加不顯著。見表4。

表4 實(shí)驗(yàn)前、中、后水迷宮游水時間比較（x±s）

3 討論

血清、腦Al3+模型組均顯著高于正常組、治組，長期用氯化鋁喂養(yǎng)小鼠，經(jīng)消化道吸收，可導(dǎo)致其體內(nèi)鋁含量升高，高鋁是否可導(dǎo)致老年癡呆癥（AD）還未定論，AD的發(fā)病原因和機(jī)制，目前還不清楚，尚在學(xué)說階段，如遺傳學(xué)說、神經(jīng)學(xué)說、膽堿能傳導(dǎo)學(xué)說[5]、中毒學(xué)說（鉛中毒、鋁中毒學(xué)說）等，但還缺乏直接的證據(jù)。何勝等[6]發(fā)現(xiàn)，鋁中毒小鼠大腦海馬、皮層神經(jīng)細(xì)胞有變性、壞死、凋亡等，可能會導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)紊亂，導(dǎo)致AD的發(fā)生，或作為發(fā)病的其中重要因素之一。

腦AchE，模型組顯著高于治療組、正常組；血清AchE正常組顯著低于治療組、模型組（P＜0.01）。乙酰膽堿是膽堿能神經(jīng)分泌的神經(jīng)遞質(zhì)，由乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶催化膽堿和乙酰輔酶A為原料合成[7]，而（AchE）乙酰膽堿酯酶是催化乙酰膽堿分解成乙酸和膽堿的酶，2種酶控制著乙酰膽堿的合成與分解，從而保持平衡，維持膽堿能神經(jīng)的正常功能，而膽堿能神經(jīng)目前被認(rèn)為與記憶功能有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M顯著高于治療組、正常組，說明乙酰膽堿的合成與分解平衡已被打破，記憶功能會出現(xiàn)障礙，而鐵皮石槲治療組接近正常組，說明有所改善或好轉(zhuǎn)[8]。

血清、腦MDA模型組均顯著高于其他2組，MDA是不飽和脂肪酸氧化分解產(chǎn)物，其含量與氧化分解有關(guān)，反映機(jī)體的抗氧化能力，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M均顯著高于其他2組，說明抗氧化能力下降，用鐵皮石槲藥液灌喂治療后，情況有所好轉(zhuǎn)。

[1] 張寶第，郭雄．鋁致阿爾茨海默病的分子機(jī)制[J]．國外醫(yī)學(xué)地理分冊，2002,24（2）：57-59.

[2] 李韜，陳菊芳，玉瑩，等．中藥口服液對鋁致老年癡呆癥小鼠治療效果的實(shí)驗(yàn)研究[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,2012,38(4)：224-227.

[3] 黃志海，黃結(jié)麗.HPLC測定石槲夜光顆粒中小檗堿含量[J].中國中藥雜志，2005,30（14）：1130.

[4] 李海,玉瑩,楊彩梅,等．鋁致小鼠大腦形態(tài)與功能的變化及中藥治療的研究[J]．中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2011,24(1)：40-42.

[5] 梁漢周,梁雁,黃波.老年癡呆病的發(fā)病機(jī)制及臨床藥物治療分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2013,19(22)：150-151.

[6] 何勝，黃杰林，李佩蕾，等.中藥對老年癡呆癥小鼠干預(yù)作用[J]．中國公共衛(wèi)生，2014，30（4）：448-450.

[7] 常一丁.中樞膽堿能系統(tǒng)的改變對老年癡呆大鼠行為的影響[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2008,14(11)：27-29.

[8] 余文珍,王曉寧,施紅.石槲合劑對衰老糖尿病大鼠胰腺P53表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012,30(11)：2327-2399.

Objective To investigate the effect of dendrobium officinale on biochemical indices in mice treated with high aluminum feeding. Methods Mice were feeded with AlCl3mix fodder for four months, then the mice in experimental group were treated with dendrobium officinale extract by intragastric administration for 21 days until the end of the experiment. To test the memory of mice by water maze before,in the middle and after experiment. Got venous blood to test at the end of the experiment after four months, took brain and made it into 10% brain homogenate after the mice were killed. To determine acetylcholinesterase (AchE), glutathioneperoxidase (GSH-PX),malondialdehyde (MDA), cholesterol (TC), aluminum (Al3+) content, etc. Results The brain homogenate AchE in experimental group, model group and control group were (0.59±0.16), (0.85±0.09) and (0.62±0.13) U/mgprot respectively, there is statistical difference between model group compare with experimental group and control group (P＜0.01). The aluminum (Al3+) of brain homogenate were (0.61±0.10), (0.72±0.06) and (0.59±0.05) μg/mL respectively, there is significant difference between model group and control group (P＜0.01). MDA of brain homogenate were (2.80±0.52), (4.51±1.29) and (3.21±1.48) nmol/mL respectively, it is higher in model group then other two groups (P＜0.01). It needed much more time in Y water maze swimming in later stage in model and control groups, there is statistical difference (P＜0.05), but no statistical difference in experimental group. No statistical difference of GSH-PX and TC among the three groups . Conclusion Brain homogenate , serum aluminum, AchE activity and MDA content of mice are all increasing significantly after feeded with high alumina , and it will be improved significantly after intake dendrobium officinale extract.

Dendrobium officinale; Aluminum; Acetylcholinesterase (AchE)

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.30.001

廣西壯族自治區(qū)教育廳科研基金（2013YB188）

廣西 533000 右江民族醫(yī)學(xué)院重金屬與氟砷毒物研究實(shí)驗(yàn)室（何勝 林美情 鄧曉珍 潘霖 鐘絹 寧梅 韋健全 張樹球）

林美情 E-mail:sqzhang224@163.com