余 瑛

分子靶向治療在婦科惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

余 瑛

目的 探討分子靶向治療在婦科惡性腫瘤中的研究進(jìn)展情況。方法 選用人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞作為研究細(xì)胞，分析RNA干擾（RNAi）對高表達(dá)VEGF基因的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞的影響。對樣品細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，定量檢測其VEGF-mRNA的表達(dá)情況和其VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，并和空白對照組以及陰性對照組相比較。結(jié)果 和空白對照組相比，干擾組的VEGF mRNA在各時(shí)相的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；和空白對照組相比，陰性對照組的VEGF mRNA在各時(shí)相的表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和空白對照組相比，干擾組的VEGF165蛋白表達(dá)在各時(shí)相均有明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；和空白對照組相比，陰性對照組組的VEGF165蛋白表達(dá)在各時(shí)相無明顯變化，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 VEGF是作為治療宮頸癌惡性腫瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，也為宮頸癌的臨床治療提供了新的思路。

分子靶向；惡性腫瘤；婦科；VEGF；siRNA

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女的身心健康，其發(fā)病和多種因素有關(guān)。使用分子靶向技術(shù)對惡性宮頸癌患者進(jìn)行治療是近年來科學(xué)研究的熱點(diǎn)[1-3]，本研究選用人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞作為研究細(xì)胞，分析RNA干擾（RNAi）對高表達(dá)VEGF基因的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選用人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞作為研究細(xì)胞，分析RNA干擾（RNAi）對高表達(dá)VEGF基因的宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞的影響。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備和siRNA干擾 取出從液氮罐中保存的細(xì)胞凍存管，迅速置入37℃～38℃的水浴中，持續(xù)搖動，使其融化。將凍存管內(nèi)的液體小心移入離心管內(nèi)，加入培養(yǎng)液10mL輕緩吹打混勻，500rpm離心10min。除去上清液后加入5mL培養(yǎng)液，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃下靜置培養(yǎng)，2d后待到細(xì)胞大部分貼壁時(shí)更換溶液。然后對細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行凍存，然后進(jìn)行細(xì)胞消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)收集5×106～1×107個(gè)細(xì)胞后，再次500rpm離心10min。對細(xì)胞進(jìn)行凍存保存，2周后取出凍存細(xì)胞復(fù)蘇。檢測細(xì)胞活性然后進(jìn)行siRNA的轉(zhuǎn)染，根據(jù)GenBank中人VEGF165基因的mRNA序列設(shè)計(jì)siRNA，對體系進(jìn)行優(yōu)化后選擇最佳體系，在6孔板上接種Hela細(xì)胞，當(dāng)融合達(dá)到80%后進(jìn)行siRNA干擾。

1.2.2 RNA濃度和純度測定 取每份樣品4μL，加入無RNA酶的蒸餾水稀釋50倍，試驗(yàn)紫外分光光度計(jì)在260nm下進(jìn)行測量。RNA濃度（μg/uL）=OD260×核酸稀釋倍數(shù)× 40/1000。在260nm和280nm下測定RNA純度。

1.2.3 RNA完整性測定和熒光定量測定 對siRNA轉(zhuǎn)染后的樣品進(jìn)行RNA完整性測定，確保提取的RNA比較完整，然后進(jìn)行熒光定量測定，檢測VEGF mRNA的表達(dá)水平。

1.2.4 VEGF165蛋白表達(dá)分析 將備用細(xì)胞刮下加入蛋白細(xì)胞裂解液后離心，取上清液作為樣品。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳試驗(yàn)，割取待測膜條使用鼠抗人VEGF165單克隆抗體的一抗和辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各時(shí)相不同組VEGF mRNA的表達(dá)情況 研究結(jié)果顯示,和空白對照組相比,干擾組的VEGF mRNA在各時(shí)相的表達(dá)明顯下降，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；和空白對照組相比陰性對照組的VEGF mRNA在各時(shí)相的表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 不同時(shí)相各組VEGF mRNA對比情況

2.2 各時(shí)相VEGF165蛋白表達(dá)情況 和空白對照組相比,干擾組的VEGF165蛋白表達(dá)在各時(shí)相均有明顯下降，差異顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；和空白對照組相比,陰性對照組組的VEGF165蛋白表達(dá)在各時(shí)相無明顯變化，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，其原位癌高發(fā)年齡為30～35歲，浸潤癌為45～55歲，嚴(yán)重危害婦女的身心健康。宮頸癌的發(fā)病可能和病毒感染、性行為、分娩次數(shù)、不良生活習(xí)慣等多種因素相關(guān)[4-7]。

宮頸癌患者比較典型的臨床癥狀包括陰道流血、陰道排液等。早期多為接觸性出血，中晚期為不規(guī)則陰道流血。出血量根據(jù)病灶大小、侵及間質(zhì)內(nèi)血管情況而不同。年輕患者也可表現(xiàn)為經(jīng)期延長、經(jīng)量增多，老年患者常為絕經(jīng)后不規(guī)則陰道流血。一般外生型較早出現(xiàn)陰道出血癥狀，出血量多，內(nèi)生型較晚出現(xiàn)該癥狀。陰道液體一般為白色或血性，可稀薄如水樣或米泔狀，或有腥臭。晚期患者因癌組織壞死伴感染，可有大量米湯樣或膿性惡臭白帶。晚期患者還可能根據(jù)癌灶累及范圍出現(xiàn)不同的繼發(fā)性癥狀，如尿頻、尿急、便秘、下肢腫痛等，如癌腫壓迫或累及輸尿管時(shí)，可引起輸尿管梗阻、腎盂積水及尿毒癥，晚期可有貧血、惡病質(zhì)等全身衰竭癥狀。

臨床常見的檢查方法包括宮頸刮片細(xì)胞學(xué)檢查、宮頸碘試驗(yàn)、陰道鏡檢查、宮頸和宮頸管活組織檢查等。

目前臨床常見的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療、化療，但是對于許多晚期患者療效往往有限，因此研究新型的治療方法是必須的。分子靶向治療是近年來研究報(bào)道較多的一種治療方法，將新生血管作為靶點(diǎn)的治療方法也是近年來的研究熱點(diǎn)[8]。

許多研究表明腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移和其血管的增生有密切關(guān)系，血管的形成在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色。許多細(xì)胞因子參與了這一過程，其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）就是重要的調(diào)控因子之一。使用RNA干擾技術(shù)，將內(nèi)源性的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞并發(fā)生特異性降解，進(jìn)而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默是治療惡性腫瘤的新型方法[8]。本研究將VEGF165作為靶向基因，使用siRNA對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞其VEGF-mRNA的表達(dá)和其VEGF蛋白表達(dá)均受到抑制，說明VEGF是作為治療宮頸癌惡性腫瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，也為宮頸癌的臨床治療提供了新的思路。

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[6] 李翔,魯艷明,張淑蘭.微小RNA在婦科惡性腫瘤中的研究進(jìn)展[J].國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2011,3(11)：234-236.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.20.039

江西 341000 江西省贛州市腫瘤醫(yī)院 (余瑛)