危智盛 黃葉青 刁勝朋 洪銘范

超大劑量甲潑尼龍治療實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎的療效分析

危智盛 黃葉青 刁勝朋 洪銘范

目的 研究超大劑量甲潑尼龍（MP）對實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（EAE）大鼠的治療作用，探討超大劑量MP能否提高療效。方法 構(gòu)建EAE大鼠模型，分為超大劑量組、小劑量組和模型對照組，分別予以尾靜脈注射MP100mg/kg、25mg/kg、等體積生理鹽水；另取正常大鼠為正常對照組，給予等體積生理鹽水注射。連續(xù)給藥5d，處死大鼠，采血檢測血漿白細(xì)胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。取腦、脊髓組織行HE染色及髓鞘染色。對臨床評分、炎性病灶計(jì)數(shù)、髓鞘脫失評分、細(xì)胞因子含量等進(jìn)行綜合評價(jià)。結(jié)果 超大劑量組和小劑量組大鼠經(jīng)MP治療前后臨床評分差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，組織炎性病灶數(shù)、髓鞘脫失評分及血漿IL-2、TNF-α含量均較模型對照組低。而超大劑量、小劑量組間在臨床評分、炎性病灶數(shù)、髓鞘脫失評分、細(xì)胞因子含量等方面比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 兩種劑量MP均能緩解EAE癥狀，改善病情，但臨床療效并不與劑量呈依賴性，在一定的有效劑量范圍內(nèi)，超大劑量MP并不能提高療效。

甲潑尼龍；實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎；糖皮質(zhì)激素；白細(xì)胞介素-2；腫瘤壞死因子-α

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）炎癥性、脫髓鞘性自身免疫性疾病。對于MS急性發(fā)作和復(fù)發(fā)，循證醫(yī)學(xué)A級證據(jù)推薦使用大劑量甲潑尼龍（methylprednisolone，MP）短程沖擊治療[1-2]。然而，目前MP使用劑量尚不統(tǒng)一，有學(xué)者認(rèn)為2000mg/d MP沖擊治療MS，在一定程度上可優(yōu)于500mg/d及1000mg/d[3-4]。也有研究表明大劑量與小劑量MP治療MS在臨床療效上比較并無顯著差異[5]。因此，目前臨床醫(yī)生常根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)采用500mg/ d、1000mg/d或2000mg/d MP沖擊治療MS。由于使用大劑量糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）治療同時可造成嚴(yán)重不良反應(yīng)，因此，選擇恰當(dāng)?shù)挠行┝渴桥R床醫(yī)生迫切關(guān)注的問題。目前相關(guān)的實(shí)驗(yàn)論證不多，且針對GC治療MS或MS動物模型─實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎（experimental allergic encephalomyelitis，EAE）的量效關(guān)系的研究甚少。本研究擬通過超大劑量MP對EAE大鼠進(jìn)行沖擊治療，從臨床評分、病理改變、細(xì)胞因子等多個角度觀察，比較其與小劑量MP的療效差異，探討MP的量效關(guān)系，以證實(shí)超大劑量MP是否能提高療效，為臨床選擇恰當(dāng)?shù)腉C劑量治療MS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑 雌性Wistar大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量180～200g；豚鼠，雌雄不限，體質(zhì)量350～400g，購自南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（輝瑞公司）；白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）放射免疫檢測試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所。

1.2 EAE模型制備 參照文獻(xiàn)[6]方法制備EAE模型。免疫接種后，每日觀察大鼠反應(yīng)，包括進(jìn)食、體質(zhì)量、行動等情況，并參照Becher的標(biāo)準(zhǔn)[7]對大鼠神經(jīng)損害表現(xiàn)進(jìn)行臨床評分：正?；驘o任何神經(jīng)缺損癥狀計(jì)為0分；尾巴遠(yuǎn)端無力計(jì)0.5分；尾巴完全無力計(jì)1分；尾巴無力并后肢無力計(jì)1.5分；單側(cè)后肢部分癱瘓計(jì)2分；雙側(cè)后肢部分癱瘓計(jì)2.5分；雙側(cè)后肢完全癱瘓計(jì)3分；雙后肢完全癱瘓并有一側(cè)前肢癱瘓計(jì)3.5分；四肢癱瘓計(jì)4分；瀕臨死亡狀態(tài)或死亡計(jì)5分。大鼠評分≥1分即為臨床發(fā)病。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 將EAE大鼠隨機(jī)分成3組，分別為：（1）超大劑量組：8只，給予MP 100mg/kg，生理鹽水稀釋后自尾靜脈注射；（2）小劑量組：8只，MP 25mg/kg，生理鹽水稀釋后自尾靜脈注射；（3）模型對照組：7只，給予等體積生理鹽水尾靜脈注射；(4)另取5只未經(jīng)造模的正常Wistar大鼠在同等條件下飼養(yǎng)作為正常對照組，給予等體積生理鹽水尾靜脈注射。在免疫接種第12天大鼠發(fā)病后開始給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥3d后，MP減半量再給藥2d，共給藥5次。

1.4 血IL-2、TNF-α測定 給藥5d后，各組大鼠于第6天進(jìn)行臨床評分，處死后剪斷頸部血管，采血約2mL/只，入EDTA抗凝管，離心后提取血漿約1mL，-20℃保存。按照IL-2、TNF-α放免試劑盒操作步驟，應(yīng)用中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)科技實(shí)業(yè)總公司生產(chǎn)的GC-911γ放射免疫計(jì)數(shù)器檢測大鼠血漿IL-2、TNF-α含量。

1.5 HE染色及髓鞘染色 取大鼠大腦視交叉層面2mm腦組織、小腦、腦干、脊髓頸膨大、腰膨大等部分，以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，并進(jìn)行HE染色及砂羅鉻花青法（solochrome cyanin）髓鞘染色，光鏡下觀察腦、脊髓組織的形態(tài)學(xué)改變。對脊髓HE染色切片進(jìn)行炎性病灶計(jì)數(shù)，參照標(biāo)準(zhǔn)[8]：呈袖套樣改變或者超過15～20個炎性細(xì)胞浸潤者記為1個炎性病灶。對脊髓組織髓鞘染色切片進(jìn)行髓鞘脫失評分，參照評分標(biāo)準(zhǔn)[9]：（1）軟脊膜下少量脫髓鞘改變，計(jì)1分；（2）軟脊膜下和血管周圍明顯的脫髓鞘，計(jì)2分；（3）軟脊膜下或血管周圍見脫髓鞘斑塊融合，計(jì)3分；（4）軟脊膜下和血管周圍見廣泛的脫髓鞘并累及一半的脊髓，同時伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤，計(jì)4分；（5）廣泛的軟脊膜下和血管周圍脫髓鞘并累及整個脊髓橫斷面，伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤，計(jì)5分。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以“x±s”表示；治療前后臨床評分采用Wilcoxon秩檢驗(yàn)，2組間的臨床評分、髓鞘脫失評分采用Mann-Whitney u檢驗(yàn)；多組間炎癥病灶計(jì)數(shù)以及細(xì)胞因子含量的比較采用單因素方差分析，多組均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床評分比較 免疫誘導(dǎo)后，大鼠在第10天開始陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為進(jìn)行性體質(zhì)量下降、尾巴張力減退，繼而尾巴無力，并可出現(xiàn)后肢及四肢無力、麻痹，伴有大小便失禁。超大劑量組和小劑量組大鼠經(jīng)MP治療后神經(jīng)損害癥狀均得到明顯改善，而模型對照組大鼠癥狀無改善，且部分大鼠癥狀加重。治療組臨床評分下降(P<0.05)，而模型對照組評分加重(P<0.05)。超大劑量組與小劑量組治療前后臨床評分改變的差值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 EAE大鼠臨床評分、炎性病灶數(shù)、髓鞘脫失評分比較（x±s）

2.2 炎性病灶數(shù)比較 EAE大鼠腦、脊髓組織HE染色鏡下可見小血管充血、血管壁增厚、內(nèi)皮細(xì)胞破壞，血管周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，形成典型的“袖套樣（cuffing）”改變。而正常對照大鼠腦和脊髓均無異常。對脊髓切片中炎性病灶數(shù)進(jìn)行比較，可見超大劑量組和小劑量組病灶計(jì)數(shù)顯著較模型對照組減少（P<0.001），但超大劑量組與小劑量組之間比較病灶計(jì)數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 髓鞘脫失比較 砂羅鉻花青法染色在光鏡下可見髓鞘呈藍(lán)色，膠原纖維呈粉紅色，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，EAE大鼠脊髓組織可見髓鞘均有不同程度脫失。超大劑量和小劑量組髓鞘脫失評分均較模型對照組低（P<0.05），但超大劑量組與小劑量組間進(jìn)行比較評分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 細(xì)胞因子比較 模型對照組大鼠血漿IL-2和

TNF-α含量均較正常對照組高(P<0.01)；超大劑量組與小劑量組IL-2、TNF-α含量均較模型對照組低（P<0.05），但I(xiàn)L-2與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNF-α仍高于正常水平，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。超大劑量組與小劑量組間IL-2、TNF-α含量進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 各組大鼠血IL-2、TNF-α含量比較（ng/mL，x±s）

3 討論

EAE是一種由特異性致敏的CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的，以CNS內(nèi)小血管周圍單個核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為主要特征的自身免疫性疾病[10]。其病理生理改變與人類MS極為相似，是目前國內(nèi)外研究MS發(fā)病機(jī)制及實(shí)驗(yàn)性治療的最適宜模型[11]。GC可以通過誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，下調(diào)T細(xì)胞粘附分子及調(diào)節(jié)T細(xì)胞遷移等機(jī)制達(dá)到治療EAE的作用[12]。研究已表明，EAE的病理變化與其病情的嚴(yán)重程度基本一致[13]。在MS及EAE，由于Th1細(xì)胞的過度活化，其表達(dá)的IL-2及TNF-α水平增高，而且其增高的程度可與疾病的嚴(yán)重程度相平行[14]。因此，我們從臨床評分、炎性病灶數(shù)、髓鞘脫失評分、細(xì)胞因子等多個角度來比較超大劑量MP與小劑量MP對EAE病情改善的差異，探討超大劑量MP能否優(yōu)于小劑量MP，為臨床優(yōu)化GC治療MS提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)表明，超大劑量和小劑量MP治療后，EAE大鼠神經(jīng)損害癥狀均得到顯著的改善，治療前后臨床評分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；超大劑量和小劑量組炎性病灶計(jì)數(shù)、髓鞘脫失評分、細(xì)胞因子IL-2和TNF-α含量均較模型對照組低。表明兩種劑量MP均能緩解EAE癥狀，改善病情，縮短病程。然而，無論是從臨床評分、炎性病灶計(jì)數(shù)、髓鞘脫失評分及細(xì)胞因子含量等多個方面進(jìn)行比較，超大劑量與小劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，臨床療效并不與劑量呈依賴性。我們認(rèn)為，在一定的有效劑量范圍內(nèi)，超大劑量MP尚不能提高療效。

Schmidt等[15]曾以50mg/kg、10mg/kg、1mg/kg MP等作為大、中、小劑量治療EAE大鼠，并分析其對T細(xì)胞凋亡的差異，結(jié)果表明，1mg/kg MP不能誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，而50mg/ kg則優(yōu)于10mg/kg。因此，我們采用25mg/kg作為為小劑量，100mg/kg為超大劑量，以此拉開劑量跨度，但結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)這種兩種劑量在臨床評分、炎性病灶計(jì)數(shù)、髓鞘脫失評分及細(xì)胞因子含量等方面的療效存在差異。本研究分析考慮有以下幾點(diǎn)可能：（1）大鼠對藥物的耐受范圍較大。按照體表面積計(jì)算法對動物與人的劑量進(jìn)行換算，大鼠每公斤體重劑量是人的6倍[16]。因此，在一定有效藥物濃度內(nèi)，大鼠劑量與療效可能不呈依賴性。（2）糖皮質(zhì)激素受體飽和。GC進(jìn)入細(xì)胞漿后，與胞漿內(nèi)GR的激素結(jié)合區(qū)結(jié)合，然后進(jìn)入細(xì)胞核，啟動并調(diào)控某些具有一定生物學(xué)效應(yīng)的多肽、酶、細(xì)胞因子等基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮免疫抑制、抗炎等效應(yīng)[17-18]。因此，當(dāng)GR飽和后，增大GC劑量亦無法提高GC的生物效應(yīng)。（3）實(shí)驗(yàn)樣本量不夠大。本實(shí)驗(yàn)MP治療各組大鼠樣本量尚不夠大，可能在統(tǒng)計(jì)過程易出現(xiàn)偏差。對于MP劑量設(shè)計(jì)上也可能存在不足。以大鼠每公斤體重用藥劑量相當(dāng)于人的6倍為標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)所用超大劑量100mg/kg MP，約相當(dāng)于給予60kg體質(zhì)量患者1000mg/d的MP沖擊治療，因此，今后我們還可以設(shè)計(jì)更大劑量MP，研究其對EAE大鼠的療效。GC對MS或EAE的作用機(jī)制非常復(fù)雜，劑量與療效關(guān)系的研究亦還有待更深入探討。

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Objective To evaluate the therapeutic effects of super-high dose of methylprednisolone (MP) in experimental allergic encephalomyelitis (EAE), and to investigate whether a super-high dose of MP improves its efficacy. Methods EAE models were induced by Wistar rats, and then the EAE rats were randomly divided into three groups (super high-dose group, low-dose group, and model control group). Super highdose group and low-dose group were given MP at a dose of 100 and 25 mg/kg i.v., respectively. Model control group and normal control groups were injected with an equivalent volume of 0.9% saline solution. The rats were sacrificed after five consecutive days therapy, then the plasma concentrations of interleukin-2 (IL-2) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) were measured by radioimmunoassay. Pathological feature and myelin of spinal cord was observed by HE staining and myelin staining respectively. The efficacy of super high-dose and low-dose MP was evaluated by analyzing clinical score changes, demyelination scores, inflammatory foci and the cytokine concentrations. Results The clinical scores of EAE rats in super high-dose and low-dose group after MP treatment were significantly lower than that before treatment, and the counts of inflammatory foci, scores of demyelination and concentrations of IL-2 and TNF-α in super high-dose and low-dose group were significantly lower than that in model control group. However, there were no significant differences in those aspects between super high-dose group and low-dose groups. Conclusion Both MP doses had similar therapeutic effects, but there is no dependent correlation between dosage and therapeutic effects, to some effective dose range, super high-dose of MP does not improve efficacy.

Methylprednisolone; Experimental allergic encephalomyelitis; Glucocorticoid; Interleukin-2; Tumor necrosis factor-α

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.16.001

廣東 510080 廣東藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 （危智盛 黃葉青 刁勝朋 洪銘范）