鄧 瑾 葉家才 黃賴機(jī) 廖志偉

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療科，廣東 廣州 510095

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見的腫瘤，盡管神經(jīng)外科學(xué)在近年來得到飛速發(fā)展，但目前膠質(zhì)瘤的臨床療效并沒有取得突破性進(jìn)展。放療是腦膠質(zhì)瘤綜合治療的重要手段，但由于多數(shù)膠質(zhì)瘤對放療敏感性較低，放療效果并不理想[1]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelialmesenchymal transition，EMT）在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。細(xì)胞發(fā)生EMT后表現(xiàn)為對放療和藥物治療的抵抗，并成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。

目前腫瘤細(xì)胞耐受放射線的機(jī)制尚未完全闡明，有研究認(rèn)為實體瘤中普遍存在的缺氧是影響放射敏感性的重要原因之一[2]。缺氧微環(huán)境對腫瘤遷移和進(jìn)展具有極其重要作用。越來越多的研究表明，缺氧促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移與腫瘤EMT有關(guān)[3-4]。既往研究已經(jīng)顯示氯化鈷（CoCl2）能模擬體內(nèi)缺氧環(huán)境。因此，本研究擬通過氯化鈷模擬體內(nèi)缺氧環(huán)境，進(jìn)一步討論氯化鈷對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT和侵襲能力的影響，為膠質(zhì)瘤治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株T98G購自中科院上海細(xì)胞庫，按常規(guī)方法生長在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的High Glucose DMEM培養(yǎng)基中，處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細(xì)胞用0.05%胰酶消化傳代，取指數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。實驗分三組，分別接種至60 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞融合度為80%左右時，以0.3%的低血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h使其同步化，然后向其中一皿加入二甲基亞砜（DMSO）作為對照孔，另外兩皿中加入氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧，濃度分別為 100、200 μmol/L。

1.2 蛋白印跡法檢測EMT標(biāo)記蛋白表達(dá)

以氯化鈷誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧后，收集各組細(xì)胞，裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，從收集的細(xì)胞蛋白提取物中取5 μL進(jìn)行蛋白定量。定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，放置5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h。用5%的脫脂奶粉稀釋鈣黏蛋白 （E-cadherin）（1∶500）和波形蛋白（Vimentin）（1∶2000）。含目的條帶的膜與稀釋后一抗4℃孵育過夜，TBS沖洗。辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗，室溫孵育1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色，暗室膠片成像，結(jié)果掃描并定量，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參照。各蛋白的相對含量通過目的條帶的灰度值與內(nèi)對照條帶灰度值的比值表示，通過觀察電泳條帶的深淺強(qiáng)度判斷EMT蛋白的表達(dá)水平。

1.3 Transwell和Boyden體外遷移實驗

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液后計數(shù)，調(diào)整濃度為2.0×105/mL；Boyden實驗在小室下部加入一定量基質(zhì)膠。將細(xì)胞加入Transwell或Boyden的上室，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液。在Transwell或Boyden小室底部加入700 μL無血清培養(yǎng)基。同時在對照孔中加入DMSO，在處理組中加入終濃度為200 μmol/L的氯化鈷。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，每組細(xì)胞做3個平行孔。取出小室，用鑷子小心取出濾膜，吸干上室液體，甲醇室溫固定30 min；結(jié)晶紫染色。用棉簽擦去上層膠和上室未穿膜的細(xì)胞。在顯微鏡100倍光鏡下隨機(jī)挑取10個視野計數(shù)穿膜的細(xì)胞。以遷移細(xì)胞的絕對數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯化鈷誘導(dǎo)缺氧對T98G細(xì)胞形態(tài)的改變

將在生長對數(shù)期的T98G細(xì)胞接種至60 mm培養(yǎng)皿，共2皿。待細(xì)胞融合度為70%左右時，換上低血清（0.3%胎牛血清）培養(yǎng)基，向其中一皿加入DMSO作為對照孔，另外一皿中加入氯化鈷，使其終濃度為200 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞大小較為均一，細(xì)胞邊緣輪廓整齊清晰。200 μmol/L的氯化鈷處理后的細(xì)胞，細(xì)胞輪廓較為粗糙，細(xì)胞呈現(xiàn)顯著梭型變，部分細(xì)胞開始脫落。具體形態(tài)見圖1。

圖1 氯化鈷誘導(dǎo)對T98G細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）

2.2 氯化鈷對T98G細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

分別用100 μmol/L和200 μmol/L的氯化鈷處理細(xì)胞后，檢測EMT標(biāo)記蛋白E-cadherin和Vimentin的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，相對于對照組細(xì)胞，氯化鈷處理細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧后，E-cadherin表達(dá)顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），而Vimentin的表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。100 μmol/L氯化鈷處理細(xì)胞后，E-cadherin 的表達(dá)由 （100.0±12.1）%降至 （77.0±14.1）%，Vimentin 的 表 達(dá) 由 （100.0±11.5）% 增 加 至（179.4±25.4）%，隨著氯化鈷濃度增加至 200 μmol/L，E-cadherin 也進(jìn)一步降低至 （68.0±13.8）%（圖 2A），Vimentin 的表達(dá)也升高至（210.5±34.4）%（圖 2B）。但是 100 μmol/L和 200 μmol/L的氯化鈷處理的細(xì)胞E-cadherin和Vimentin的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖2 Western blot檢測不同濃度CoCl2對T98G細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白E-Cadherin和Vimentin表達(dá)的影響

2.3 氯化鈷誘導(dǎo)缺氧促進(jìn)T98G細(xì)胞體外遷移能力

通過Transwell侵襲小室觀察T98G細(xì)胞在缺氧和常氧環(huán)境下體外遷移能力的變化。如圖3A所示，以氯化鈷處理的細(xì)胞較對照組細(xì)胞遷移率顯著增加，透膜細(xì)胞數(shù)分別為（29±5）個和（53±4）個（P=0.0397）。Boyden實驗同樣顯示，氯化鈷處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，穿過小室細(xì)胞數(shù)量由對照組的（26±3）個增加至（36±2）個（P=0.0402）（圖 3B）。說明氯化鈷處理后，T98G 細(xì)胞遷移及侵襲能力顯著增加。

圖3 Transwell和Boyden法檢測氯化鈷對T98G細(xì)胞體外侵襲能力的影響

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的腫瘤。以往腦膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)為主，但鑒于腦組織功能的特殊性，手術(shù)難以擴(kuò)大切除范圍，術(shù)后易復(fù)發(fā)。放療是腦膠質(zhì)瘤術(shù)后重要的治療手段，但是腦膠質(zhì)瘤放射敏感性存在很大差異。EMT在膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，是腫瘤轉(zhuǎn)移和放化療抵抗的重要因素。目前腫瘤細(xì)胞耐受放射線的機(jī)制尚未完全闡明，有研究表明腫瘤微環(huán)境缺氧可能是影響腫瘤細(xì)胞放射敏感的重要因素[5]。

細(xì)胞失控性生長是惡性腫瘤的主要特征，不斷增多的細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞耗氧量的增加，從而造成腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境的形成。缺氧可以使細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。缺氧也給腫瘤的治療帶來不便，腫瘤多種惡性生物學(xué)行為包括放化療抵抗、增殖和血管生成等都與缺氧相關(guān)[6]。

缺氧誘導(dǎo)模型主要有兩種，即物理缺氧模型和化學(xué)缺氧模型。物理缺氧模型通過改變氧分壓，使細(xì)胞處于低氧狀態(tài)，其優(yōu)點是與體內(nèi)細(xì)胞缺氧的生理狀況相接近，但需要專業(yè)的設(shè)備和器械，費用高昂。而化學(xué)缺氧模型通過氯化鈷抑制低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的特異性脯氨酸羥化酶而抑制HIF-1α的強(qiáng)化，從而阻斷其泛素化降解，進(jìn)而活化HIF-1α信號通路。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，氯化鈷可使T98G細(xì)胞HIF-1α蛋白水平明顯升高，且其在一定的時間劑量范圍內(nèi)是安全的，并不造成顯著的細(xì)胞毒性[7]。更重要的是，Manotham等[8]同樣通過氯化鈷來模擬低氧環(huán)境。因此，本實驗選擇氯化鈷化學(xué)缺氧模型研究膠質(zhì)瘤T98G細(xì)胞在缺氧條件下的生物學(xué)特性。

EMT在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，腫瘤細(xì)胞通過EMT獲得侵襲性表型，使得其游走遷移能力及降解細(xì)胞外基質(zhì)能力增強(qiáng)。在EMT的發(fā)生過程中，細(xì)胞表型發(fā)生相應(yīng)改變：一方面，腫瘤細(xì)胞喪失了上皮表型如E-cadherin和β-catenin的表達(dá)；另一方面又獲得了間充質(zhì)表型如Vimentin和Fibronectin等表達(dá)[9-10]。缺氧是誘導(dǎo)癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的重要生物因素之一[11]。本實驗結(jié)果表明氯化鈷誘導(dǎo)缺氧后，T98G細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)記表型E-cadherin表達(dá)降低，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)增加，提示氯化鈷誘導(dǎo)缺氧后T98G細(xì)胞發(fā)生EMT。腫瘤細(xì)胞本身的遷移和運動能力在腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，通過Transwell侵襲小室實驗進(jìn)一步說明缺氧誘導(dǎo)T98G細(xì)胞EMT變化后，T98G細(xì)胞遷移能力明顯增加。因此逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)EMT將可能抑制T98G細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。與本研究結(jié)果一致的是，Zhang等[12]研究顯示，氯化鈷能通過低氧促進(jìn)Snail1表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生和肝癌細(xì)胞侵襲能力；更重要的是，去除氯化鈷后能逆轉(zhuǎn)其所誘導(dǎo)的EMT，Snail1 mRNA和蛋白表達(dá)水平同樣下降至未處理時水平。Duan等[13]研究通過氯化鈷建立體外低氧模型，而這種通過氯化鈷誘導(dǎo)低氧導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的增加以及EMT的發(fā)生能被姜黃素逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，氯化鈷模擬體外缺氧可以促進(jìn)T98G膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，并增加腫瘤細(xì)胞遷移能力。以上發(fā)現(xiàn)為未來膠質(zhì)瘤治療提供了可能的靶點和理論依據(jù)，為我們針對腫瘤周圍的低氧環(huán)境提供了理論基礎(chǔ)。

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