孫昭 薛春玲 高鶴麗 白春梅 趙林 韓欽#

1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京100730

2中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所組織工程中心，北京100005

脂肪間充質(zhì)干細胞分泌的Exosome促進結(jié)腸癌細胞系上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化△

孫昭1薛春玲2高鶴麗1白春梅1趙林1韓欽2#

1中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京100730

2中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所組織工程中心，北京100005

目的研究間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）來源的Exosome對結(jié)腸癌細胞系HCT8上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）的影響。方法從人脂肪組織中分離出MSC后，對MSC進行培養(yǎng)并傳代，并對MSC的分化能力進行鑒定。在人脂肪來源的MSC中提取Exosome后，用透射電子顯微鏡觀察并拍照，并用蛋白質(zhì)印跡法檢測其抗原表達情況。在HCT8培養(yǎng)體系中加入人脂肪來源的MSC分泌的Exosome，定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測上皮和間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標志物的表達，細胞侵襲和遷移實驗檢測人脂肪來源的MSC分泌的Exosome對HCT8遷移和侵襲的影響。結(jié)果人脂肪來源的MSC具有多系分化能力，人脂肪來源的Exosome直徑為40～100 nm，表達CD63、HSP70和HSP90，下調(diào)HCT8上皮相關(guān)標志E-cadherin和ZO-1的表達，上調(diào)間質(zhì)相關(guān)標志Fibronectin的表達，促進HCT8的遷移和侵襲。結(jié)論人脂肪來源的MSC分泌的Exosome可促進結(jié)腸癌細胞系HCT8的EMT。

間充質(zhì)干細胞；Exosome；結(jié)腸癌；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Oncol Prog,2015,13(3)

腫瘤的生物學行為并不完全由腫瘤細胞本身所決定，腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用越來越受到研究者的重視。MSC雖然只占腫瘤組織中細胞總數(shù)的0.01%～1%[1]，但是其對腫瘤的發(fā)展有著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的MSC具有促進上皮來源的腫瘤細胞EMT的作用[2-3]，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。但是，MSC調(diào)控腫瘤細胞EMT的機制仍需被進一步闡明。Exosome是活細胞內(nèi)多囊內(nèi)吞體分泌的、并通過膜融合來分泌到細胞外的、直徑多為30～100 nm的小囊泡體，可在細胞間傳遞多種分子。本研究探討MSC分泌的Exosome對結(jié)腸癌EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

成人脂肪組織取自在北京協(xié)和醫(yī)院整形外科接受吸脂手術(shù)的25～35歲的健康女性，研究經(jīng)中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所倫理委員會批準，供者均簽署知情同意書。從脂肪組織中分離MSC的方法簡述如下：將吸脂術(shù)采集的脂肪組織用D-Hanks緩沖液洗去血細胞和麻醉藥，再用0.2%Ⅱ型膠原酶消化1 h，之后用D-Hanks緩沖液洗滌2遍以除去膠原酶，離心收集細胞。細胞以2×106/m l的密度接種于含95%的DMEM/F-12（購自Gibco公司）、5%的胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS；購自Hyclone公司）、20 ng/m l表皮細胞生長因子（epidermal grow th factor，EGF）、100 U/m l鏈霉素和100 U/m l青霉素的培養(yǎng)基中，并在37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1天后換液，棄去未貼壁的細胞，以后每3天進行半量換液。當細胞融合達70%～80%時，用0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA進行常規(guī)消化，并將細胞按照1∶3的比例進行傳代。

1.2 MSC分化能力的鑒定

取第6代人脂肪來源的MSC以2×104/m l的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中，貼壁過夜并觀察，細胞融合達70%～80%后，分兩組，分別將培養(yǎng)基更換為成骨誘導培養(yǎng)液（H-DMEM培養(yǎng)基中加入10%的FBS、100 nmol/L地塞米松、0.2 mmol/L維生素C和10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉）和成脂誘導培養(yǎng)液（高糖DMEM培養(yǎng)基中加入10%的FBS、1×10-6mol/L地塞米松、50μg/m l維生素C和100μg/m l的IBMX），繼續(xù)培養(yǎng)，每隔兩天進行一次半量換液，MSC分化能力的鑒定方法為茜素紅染色（成骨）和油紅O染色（成脂）。茜素紅染色鑒定成骨分化的原理為：沉積的鈣與茜素紅發(fā)生顯色反應，在細胞外基質(zhì)中被染成橘紅色，細胞本身則被染成粉紅色；MSC成骨誘導分化12天的細胞用PBS沖洗2次，95%乙醇固定10m in，雙蒸水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris-HCL 37℃，30m in，蒸餾水沖洗，干燥，封片；倒置顯微鏡下觀察。陽性結(jié)果判定為：在細胞外基質(zhì)中可見被染成橘紅色的礦化結(jié)節(jié)。油紅O染色鑒定成脂分化的原理為：油紅O易溶于脂質(zhì)；MSC成脂誘導分化12天的細胞用PBS沖洗2次后，用中性甲醛固定10m in，蒸餾水沖洗，每孔加500μl油紅O工作液，染色5m in，甘油封片；倒置顯微鏡下觀察。陽性結(jié)果判定為：細胞質(zhì)中的脂滴被染成圓形飽滿的亮紅色。

1.3 Exosome的提取與鑒定

將第6～8代培養(yǎng)的人脂肪來源的MSC繼續(xù)培養(yǎng)48小時后更換為無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收取上清，離心去細胞碎片，然后用100 000MW分子量的濾膜過濾后進行濃縮（200m l濃縮至1～2m l），濃縮后的Exosome用透射電子顯微鏡觀察并拍照，并用蛋白質(zhì)印跡法檢測其抗原表達。

提取Exosome總蛋白，經(jīng)BCA法定量，取40mg總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上。一抗CD63（購自Lifetechnology公司），以及HSP70和HSP90（均購自Santa Cruz公司）1∶1000在4℃下過夜，內(nèi)參為GAPDH（購自Santa Cruz公司），二抗室溫孵育1 h，ECL法熒光顯色，并拍照。

1.4 上皮和間質(zhì)相關(guān)標志蛋白表達的檢測

結(jié)腸癌細胞系HCT-8購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心，在含10%FBS的HDMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3天進行常規(guī)消化傳代。將其以1×105/m l的密度接種于6孔板，加入1000 g/m l的MSC來源的Exosome，每3天進行常規(guī)消化傳代，在第10天時常規(guī)提取HCT8的總RNA和總蛋白。

實驗分為對照組和Exosome處理組，Exosome處理組在HCT8的培養(yǎng)基中加入人脂肪來源的MSC分泌的Exosome，兩組于第10天分別用定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測其上皮和間質(zhì)相關(guān)的標志蛋白在mRNA水平和蛋白水平的表達。

蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡法檢測的方法具體如下：提取細胞總蛋白，經(jīng)BCA法定量，兩組取40mg總蛋白進行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉(zhuǎn)到PVDF膜上。一抗E-cadherin（購自R&D公司），ZO-1、Fibronectin、Vimentin、Sip1（均購自Santa Cruz公司），1∶1000在4℃下過夜，內(nèi)參為GAPDH，二抗室溫孵育1 h，ECL法熒光顯色，并拍照。

用Trizol法抽提總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，基因表達水平用定量PCR檢測（SYBR法），定量PCR數(shù)據(jù)的計算方法是每份模板做3個平行樣。

采用GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法來計算各組樣品mRNA表達的相對值，公式為：ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組－ΔCt對照組，相對表達量= 2－ΔΔCt。引物序列見表1。

1.5 MSC來源的Exosome對HCT8細胞遷移和侵襲影響的檢測

為進一步分析人脂肪來源的MSC分泌的Exosome對HCT8 EMT的影響，本研究檢測了對照組（HCT8未處理組）和Exosome處理組HCT8細胞系的遷移和侵襲能力。細胞侵襲和遷移實驗在Transwell（Costa）小室中進行，

細胞遷移實驗方法為：Transwell下室內(nèi)加入500μl含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基，將Transwell小室放入下室內(nèi)；將HCT8未處理組和Exosome處理組各200m l的細胞懸液（1×106/m l）分別加入Transwell上室內(nèi)，置于37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫法染色，用顯微鏡觀察遷移細胞數(shù)。分別取4個40倍鏡下的視野，拍照、計數(shù)后，計算每個視野下的平均細胞數(shù)。

侵襲實驗方法是在Transwell小室內(nèi)預先鋪ECM膠，培養(yǎng)72 h后固定。其他部分同遷移實驗。

1.6 統(tǒng)計學方法

定量PCR和Transwell的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗和單因素方差分析進行檢驗。雙側(cè)檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。每組實驗至少重復3次以校正P值和控制系統(tǒng)誤差。

2 結(jié)果

2.1 人脂肪來源的MSC具有多系分化能力

從成人脂肪中提取的MSC具有典型的成纖維樣細胞的形態(tài)；在成骨或者成脂誘導的第12天時，分別予以茜素紅染色（圖1A）或油紅O染色（圖1B），均為陽性，證明其具有成脂和成骨的分化能力。

2.2 Exosom e的鑒定

從人脂肪來源的MSC培養(yǎng)上清中提取Exosome，用蛋白質(zhì)印跡法法檢測其抗原表達的結(jié)果為CD63、HSP70、HSP90均陽性（圖1C），和Lin等[4]的研究結(jié)果相似。透射電子顯微鏡下，觀察到Exosome為40～100 nm的小囊泡結(jié)構(gòu)（圖1D）。

2.3 上皮和間質(zhì)相關(guān)標志蛋白表達的檢測結(jié)果

表1 定量PCR引物序列

在HCT8的培養(yǎng)基中加入MSC來源的Exosome后，與對照組（HCT8未處理組）相比，上皮和間質(zhì)相關(guān)的標準基因在mRNA水平表達，E-cadherin顯著降低（P=0.001），ZO-1顯著降低（P= 0.002），F(xiàn)ibronectin顯著升高（P=0.0001），其他基

因在mRNA水平表達變化不明顯（圖2A）。上皮和間質(zhì)相關(guān)的標志蛋白在蛋白水平的表達結(jié)果為：與對照組（HCT8未處理組）相比，Exosome處理組上皮相關(guān)蛋白E-cadherin和ZO-1的表達水平明顯降低，而beta-catenin的表達水平變化不大；間質(zhì)相關(guān)蛋白Fibronectin的表達水平明顯增高，Vimentin的表達水平變化不大（圖2B）。

2.4 MSC來源的Exosome對HCT8細胞遷移和侵襲影響的檢測結(jié)果

細胞侵襲和遷移實驗發(fā)現(xiàn)，Exosome處理組的HCT8細胞系遷移和侵襲能力顯著增加；遷移實驗中Exosome處理組遷移過去的細胞數(shù)為（42.5± 9.1）個，對照組為（18.5±3.1）個（P=0.002）；侵襲實驗中Exosome處理組侵襲過去的細胞數(shù)為（29.0± 3.5）個，對照組為（13.1±3.7）個（P=0.001），具體見圖3。

3 討論

循環(huán)中的MSC或者鄰近正常脂肪組織中的MSC可歸巢于腫瘤組織，從而促進腫瘤的形成和發(fā)展。在腫瘤患者組織切片中，MSC所在區(qū)域腫瘤細胞的E-cadherin表達下調(diào)，Vimentin表達升高[3]；而MSC和腫瘤上皮細胞共培養(yǎng)后，可以發(fā)現(xiàn)腫瘤上皮細胞Vimentin、Snail和Slug表達增加[2]，那么MSC對腫瘤細胞的EMT的作用如何實現(xiàn)值得探討。細胞間信息交換的經(jīng)典途徑有兩條：①細胞分泌的蛋白或者激素，通過細胞間隙對鄰近的其他細胞起作用；②細胞質(zhì)膜的外表面存在的蛋白質(zhì)或糖蛋白、蛋白聚糖分子作為細胞的觸角，可以與相鄰細胞的膜表面分子進行特異性地相互識別和相互作用。但是有研究發(fā)現(xiàn)，MSC和腫瘤細胞之間的信息交換可以通過Exosome直接交換細胞質(zhì)[5]。Exosome是多種活細胞內(nèi)多泡體分泌的直徑多在30～100 nm的小囊泡體，小囊泡里面包裹的主要是細胞質(zhì)，可在細胞間傳遞多種分子。而MSC對腫瘤細胞EMT的作用也可能以Exosome作為信號傳遞的載體。

Exosome里面的成分比較復雜，富含蛋白和非編碼RNA等，而Exosome和其來源的細胞質(zhì)的成分也有很大的不同[6]。MSC分泌的Exosome對腫瘤細胞作用的報道較少。MSC分泌的Exosome不但可通過激活Wnt信號通路促進乳腺癌細胞系的EMT[4]，還可抑制乳腺癌細胞系表達血管內(nèi)皮生長因子[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤患者骨髓MSC分泌的Exosome和正常骨髓MSC分泌的Exosome的功能是不同的，前者可以促進骨髓瘤細胞增殖，而后者無此作用[7]。所以，MSC分泌的Exosome對腫瘤的作用及其機制尚不清楚。

MSC分泌的Exosome對于結(jié)腸癌的影響尚未見報道。本研究首先鑒定了人脂肪來源的MSC分泌的Exosome，其具有和既往的研究報道相似的大小和特征[4]，然后，研究了人脂肪來源的MSC分泌的Exosome對結(jié)腸癌細胞系HCT8 EMT的影響，人脂肪來源的MSC分泌的Exosome可以下調(diào)HCT8上皮相關(guān)標志物的表達，上調(diào)間質(zhì)相關(guān)標志物的表達，并且可以促進HCT8的遷移和侵襲，所以MSC對HCT8細胞EMT的影響可能是通過分泌Exosome來實現(xiàn)的。但是，本研究并沒有揭示人脂肪來源的MSC分泌的Exosome調(diào)控結(jié)腸癌細胞EMT的機制。Exosome作為細胞的外泌體，里面包含大量的蛋白和非編碼RNA；所以，下一步研究將聚焦在人脂肪來源的MSC分泌的Exosome調(diào)控結(jié)腸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移的信號通路上，這可能為結(jié)腸癌的治療提供新的靶點。

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［2］Bhattacharya SD,M i Z,Talbot LJ,et al.Human mesenchymal stem cell and epithelial hepatic carcinoma cell lines in adm ixture:concurrent stimulation of cancer-associated fibroblasts and epithelial-to-mesenchymal transitionmarkers[J].Surgery,2012,152(3):449-454.

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Exosomes from human adipose-derivedmesenchymalstem cells promoteepithelial mesenchymal transition in colon cancer△

SUN Zhao1XUEChun-ling2GAOHe-li1BAIChun-mei1ZHAO Lin1HANQin2#

1Departmentof InternalMedicine,Chinese Academy ofMedical Sciencesand Peking Union MedicalCollege Hospital,Beijing 100730,China
2Instituteof Basic Medical SciencesChinese Academy ofMedical Sciences,Schoolof Basic Medicine Peking Union MedicalCollege,Beijing 100005,China

ObjectiveTo study the influence of exosome derived from mesenchymal stem cell(MSC)on the epithelialmesenchymal transition(EMT)of colon cancer cell line HCT8.MethodMSC were separated from human adipose tissue and cultured,of which the differentiation potential was identified.The MSC-derived exosomes were observed using TEM,and the antibody expression was detected by western blot.HCT8 cells were co-cultured w ith MSC-derived exosome.The expression of epithelial and mesenchymal markers was detected by real time PCR and Western blot.Transwell chamberswere used in the in vitro migration and invasion assay.ResultHuman adipose derived MSC secreted 40-100 nm particles,which have the typical characteristics of exosomes as expressing CD63, HSP70 and HSP90.With the treatment of MSC-derived exosome,the expression of epithelial related markers E-cadherin and ZO-1 was down-regulated while the expression of mesenchymalmarker Fibronectin was up-regulated,and themigration and invasion capacity of HCT8 cellswere enhanced.ConclusionMSC-derived exosomes promotesmigration of the colon cancer cell line HCT8.

mesenchymal stem cell;exosome;colon cancer;epithelialmesenchymal transition

R735.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.16

國家自然科學基金（81101588；81472785）

#通信作者（corresponding author），e-mail:hanqinhanqin@126.com

2015-01-26)