畢研青 郝敏 周海霞 劉效方 王東關(guān)

東營(yíng)市人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，山東東營(yíng)257091

乳腺結(jié)構(gòu)紊亂中PAK4的表達(dá)及其與影像診斷的相關(guān)性

畢研青 郝敏#周海霞 劉效方 王東關(guān)

東營(yíng)市人民醫(yī)院乳腺甲狀腺外科，山東東營(yíng)257091

目的觀察乳腺結(jié)構(gòu)紊亂組織中P21活化蛋白激酶4（P21 activated protein kinases 4，PAK4）的表達(dá)及其與影像診斷的相關(guān)性，探討對(duì)乳腺結(jié)構(gòu)紊亂患者手術(shù)治療的指導(dǎo)價(jià)值。方法回顧性分析了2012年1月至2013年10月150例接受手術(shù)治療的女性乳腺疾病患者資料。采用HE染色和PAK4免疫組化染色重新檢測(cè)患者的組織標(biāo)本。結(jié)果乳腺非增生性病變組（n=50）、乳腺增生癥組（n=50）、乳腺癌組（n=50）中的PAK4表達(dá)陽(yáng)性率依次升高，且三組兩兩比較的PAK4表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。在乳腺癌組中，PAK4表達(dá)與鉬靶X線和超聲的早期診斷結(jié)果呈正相關(guān)性（均P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)AK4表達(dá)不但在乳腺非增生性病變、乳腺增生癥病變和乳腺癌中依次升高，且與乳腺癌術(shù)前影像學(xué)診斷結(jié)果呈正相關(guān)，或可用于指導(dǎo)乳腺結(jié)構(gòu)紊亂疾病的手術(shù)治療。

乳腺結(jié)構(gòu)紊亂；乳腺癌；手術(shù)治療；影像學(xué)；分子生物學(xué)；PAK4

Oncol Prog,2015,13(3)

乳腺良性疾?。╞enign breast disease，BBD）已被證實(shí)有演變?yōu)閻盒阅[瘤的風(fēng)險(xiǎn)，乳腺結(jié)構(gòu)紊亂是乳腺疾病常見的一種影像學(xué)改變，也是乳腺癌演變過程的一個(gè)階段。隨著影像學(xué)的發(fā)展，更多的檢測(cè)手段被用于乳腺疾病的檢查，因此，更多的良性病變被檢測(cè)出，這提高了評(píng)估某些結(jié)構(gòu)特殊型乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確性，對(duì)臨床手術(shù)治療具有重要的指導(dǎo)意義。乳房穿刺活檢發(fā)現(xiàn)乳腺癌及乳腺增生伴不典型增生毫無(wú)疑問是手術(shù)指征；但對(duì)乳腺增生不伴非典型增生的病變，若影像學(xué)提示為結(jié)構(gòu)紊亂的BBD，則并非明確的手術(shù)指征?，F(xiàn)代分子生物學(xué)證實(shí)，在真核細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，通路蛋白磷酸化/去磷酸化修飾間的平衡在細(xì)胞正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起著非常重要的作用，PAK4在此途徑中扮演著關(guān)鍵的角色。用免疫組化方法檢測(cè)PAK4表達(dá)水平的變化，對(duì)判斷從乳腺增生到惡變這一過程中的危險(xiǎn)因素，對(duì)乳腺癌的早期診斷及手術(shù)指征的評(píng)估等均具有重要的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月至2013年10月在東營(yíng)市人民醫(yī)院乳腺科住院手術(shù)的150例女性乳腺疾病患者標(biāo)本。其中，非增生性病變患者50例，包括囊腫20例、纖維腺瘤30例；乳腺增生患者50例，包括普通型導(dǎo)管增生（也稱為普通型中度或重度增生）30例，導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤病20例；乳腺癌患者50例（均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌）。根據(jù)病變類型將患者分為三組，其中非增生病變?yōu)锳組，患者年齡為18～55歲；乳腺增生病變?yōu)锽組，患者年齡為18～56歲；乳腺癌為C組，患者年齡為29～75歲。術(shù)前B超、鉬靶X線檢查提示乳腺結(jié)構(gòu)明顯紊亂；術(shù)后由本院病理科制取乳腺標(biāo)本蠟塊，其中部分患者接受乳腺穿刺活檢術(shù)取樣。

1.2 研究方法

每個(gè)標(biāo)本蠟塊被切片2份，每份2張，分別進(jìn)行HE常規(guī)染色和PAK4免疫組化染色。免疫組化染色步驟：標(biāo)本脫蠟入水（PBS洗2～3次，每次5min），3%H2O2室溫孵育30m in（封閉內(nèi)源性過氧化物酶），蒸餾水洗3次，每次5 m in，浸入PBS中5 min；PBS洗3次，每次5 m in，滴加血清封閉液，置于室溫下20 m in，傾去血清，直接滴加一抗，37℃孵育l～2 h；PBS洗3次，每次5m in，滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗），37℃孵育10～30 min；PBS洗3次，每次5 m in，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30 m in；PBS洗3次，每次5 m in，DAB-H2O2顯色5～10m in，隨時(shí)鏡檢（DAB用時(shí)新配）。自來水沖洗10m in，蘇木精復(fù)染2m in，鹽酸酒精分化，氨水處理；自來水沖洗10～15 m in，脫水、透明、封片。光鏡下（100倍）觀察乳腺標(biāo)本的結(jié)構(gòu)及免疫組化染色情況。

免疫組化染色HE染色由本院病理科配制，免疫組化染色PAK4抗體（ab62509）購(gòu)自Abcam生物技術(shù)有限公司。

1.3 染色及影像學(xué)判定標(biāo)準(zhǔn)

PAK4主要在乳腺腺體細(xì)胞的胞質(zhì)和（或）胞核中表達(dá)，陽(yáng)性細(xì)胞被染成棕黃色或深棕色，采用一抗來源的同品系動(dòng)物兔的正常IgG作為陰性對(duì)照，以此判斷PAK4免疫染色的特異度。結(jié)果判斷參照Campo等[1-2]的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合染色強(qiáng)度和細(xì)胞染色百分比進(jìn)行評(píng)分。

1.3.1 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 著色弱為1分，著色中度為2分，著色強(qiáng)為3分，基本不著色為0分；著色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的5%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分，＜5%為0分。

1.3.2 免疫組化結(jié)果評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 最后以陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度記分之和所得的總分進(jìn)行結(jié)果判定。0分為陰性，記為（－）；1分、2分為弱陽(yáng)性，記為（＋）；3分、4分為中等陽(yáng)性，記為（＋＋）；≥5分為強(qiáng)陽(yáng)性，記為（＋＋＋）。

1.3.3 抗體陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) PAK4免疫組化染色累計(jì)評(píng)分≥3分（中等陽(yáng)性，強(qiáng)陽(yáng)性）者為陽(yáng)性，＜3分（陰性，弱陽(yáng)性）者為陰性。免疫組化檢測(cè)結(jié)果由兩位病理學(xué)家在相同的判斷標(biāo)準(zhǔn)下雙盲判定，相同判定結(jié)果直接納入統(tǒng)計(jì)，有差異的結(jié)果經(jīng)第三位病理學(xué)家盲法判定后取三位病理學(xué)家判定結(jié)果的平均值納入統(tǒng)計(jì)。

1.3.4 鉬靶X線陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) 鉬靶X線結(jié)果提示為簇狀、泥沙樣鈣化或者毛刺樣征，邊緣模糊的結(jié)節(jié)影，美國(guó)放射學(xué)會(huì)乳腺影像報(bào)告和數(shù)據(jù)系統(tǒng)（BI-RADS）分級(jí)為Ⅳ～Ⅴ級(jí)者被判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3.5 彩超陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn) 彩超提示腫塊形態(tài)不規(guī)則，邊界不清，呈毛刺狀或蟹足狀，內(nèi)部回聲不均勻；腫塊內(nèi)見微小鈣化灶，腫塊后方回聲衰減、腫塊縱橫比＞1；腫塊內(nèi)血流信號(hào)Ⅱ～Ⅲ級(jí)，阻力指數(shù)＞0.7，提示占位性病變者被判定為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩個(gè)或多個(gè)構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PAK4在各組研究中的表達(dá)情況

PAK4在正常乳腺組織中是不著色的。本研究中，乳腺非增生性病變組（A組）、乳腺增生病變組（B組）、乳腺癌組（C組）中的PAK4表達(dá)陽(yáng)性率依次升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A、B、C三組中的PAK4表達(dá)情況兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖1～4）。

表1 三組研究對(duì)象PAK4表達(dá)情況的比較（例）

2.2 乳腺癌患者影像學(xué)特征及PAK4表達(dá)情況

50例乳腺癌組（C組）中，術(shù)前鉬靶X線判定為陽(yáng)性表達(dá)者有39例（78%），PAK4染色陽(yáng)性者也為39例；PAK4表達(dá)與鉬靶X線陽(yáng)性結(jié)果呈正相關(guān)性（表2）。

50例乳腺癌組（C組）中，術(shù)前彩超判定為陽(yáng)性者有41例（82%），PAK4染色陽(yáng)性者為39例；PAK4表達(dá)與彩超陽(yáng)性結(jié)果呈正相關(guān)性（表2）。

3 討論

據(jù)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，乳腺不典型增生發(fā)展成為乳腺癌的危險(xiǎn)性顯著增加[3]。乳腺增生包括、乳腺小葉增生癥、纖維化增生癥、乳腺癌（部分乳腺癌為乳腺增生病惡變所致）。乳腺增生與乳腺癌的關(guān)系是患者最關(guān)心的問題，也是眾多學(xué)者爭(zhēng)論和研究的焦點(diǎn)。眾多研究[4-6]均已表明：相對(duì)于非增生性乳腺良性疾病，乳腺增生不伴非典型增生者的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可小幅增加，而乳腺增生伴非典型增生患者的乳腺癌發(fā)病率明顯升高。

表2 影像學(xué)特征及PAK4在50例乳腺癌中的表達(dá)情況

影像學(xué)檢查為早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷乳腺癌的主要方法。乳腺鉬靶X線攝影具有較好的病變凸顯性能、價(jià)格低、簡(jiǎn)單實(shí)用性的特點(diǎn)，因而被作為無(wú)癥狀女性乳腺癌篩查的首選。超聲檢查無(wú)射線損傷，尤其適合妊娠、哺乳期婦女檢查及乳腺疾病的普查和隨訪。兩者結(jié)合被稱為檢查乳腺癌的“黃金組合”[7-8]。PAK家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，最早發(fā)現(xiàn)時(shí)被作為Rho GTP酶Cdc42和Racl的特異性結(jié)合物[9]，PAK4參與Cdc42Hs與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的相互作用[10]，PAK4能在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[11-13]。一些研究表明，PAK4在上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用[14-16]。乳腺癌是被廣泛研究的上皮細(xì)胞癌癥轉(zhuǎn)化的典型疾病。大量研究顯示，PAK4不但在乳腺癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于在其他腫瘤中的表達(dá)[17-19]，而且PAK4表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[20-21]。

PAK4在正常乳腺組織中是不表達(dá)的。在本研究中（圖1～4），乳腺非增生性病變、乳腺增生病變和乳腺癌中的PAK4表達(dá)陽(yáng)性率依次升高。對(duì)乳腺非增生性病變組、乳腺增生病變組和乳腺癌組病變中PAK4的表達(dá)進(jìn)行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

對(duì)50例乳腺癌患者術(shù)前彩超及鉬靶X線診斷與PAK4表達(dá)情況進(jìn)行了相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)PAK4染色結(jié)果與兩種影像學(xué)檢查的乳腺癌早期診斷呈正相關(guān)。鑒于乳腺增生不伴非典型增生且影像學(xué)提示存在明顯結(jié)構(gòu)紊亂的BBD尚缺乏明確的手術(shù)指征，筆者認(rèn)為：結(jié)合患者臨床病史、查體及影像學(xué)檢查，針對(duì)部分乳腺增生合并結(jié)構(gòu)紊亂的患者，乳腺組織穿刺聯(lián)合PAK4檢測(cè)可以判斷乳腺?gòu)脑錾膊〉綈鹤冞@一過程中的危險(xiǎn)因素，為手術(shù)治療提供重要的參考依據(jù)。后續(xù)研究將著重于乳腺良性疾病向乳腺癌發(fā)展過程中PAK4的具體變化，以期進(jìn)一步明確PAK4在乳腺增生合并影像學(xué)結(jié)構(gòu)紊亂疾病手術(shù)治療中的價(jià)值。

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Theexpression of PAK4 in structuraldisorderofmammary gland and its correlation w ith diagnostic imaging

BIYan-qing HAOM in#ZHOU Hai-xia LIU Xiao-fang WANG Dong-guan

Departmentof Thyroid and BreastSurgery,the People's Hospitalof Dongying,Dongying 257091,Shandong China

ObjectiveTo observe the PAK4(P21 activated protein kinases 4)expression in structural disorder of mammary gland,and to investigate the correlation between PAK4 and diagnostic imaging to guide surgery.Method150 female patients w ith breast disease who had surgeries during 2012 to 2013 were retrospectively analyzed.HE staining and PAK4 immunohistochemical staining were used to investigate the structure ofmammary gland in the paraffin-embedded samples.ResultThe incidence of positive PAK4 expression increased in non-hyperplasia group(n= 50),hyperplasia group(n=50)and the breast cancer group(n=50),and the differences between groups were significant(all P<0.05).PAK4 expression in breast cancer group was positively correlated w ith early diagnostic results of mammography and ultrasonography.ConclusionThe PAK4 expression increased in non-hyperplasia/hyperplasia of mammary gland,and breast cancer,besides,the PAK 4 expression was positively correlated w ith preoperative imaging diagnosis results,and m ight be an indicator for breast surgeries for structural disorder ofmammary gland disease.

structural disorder ofmammary gland;breast cancer;surgical treatment;molecular biology;PAK4

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.03.13

#通信作者（corresponding author），e-mail：haom in166@163.com

2014-11-06）