龔勁松，李恒，楊濤，錢建瑛，陸震鳴，許正宏，史勁松

（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

我國甲殼素生物質(zhì)資源儲(chǔ)量豐富，來源廣泛，是僅次于纖維素的第二大高分子物質(zhì)，每年僅蝦蟹殼等生物質(zhì)廢棄物來源的甲殼素就高達(dá)1000 多萬噸[1-3]。甲殼素在土壤中被微生物降解后，可改善土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物生長，因此可作為一種潛在的土壤改良劑[4]；甲殼素作為飼料添加劑也具有一定的市場前景，已獲得美國FDA 批準(zhǔn)；另外，甲殼素還具有較強(qiáng)的抗菌作用，因此可用于水果及肉制品的保鮮；由于安全無毒，甲殼素及其衍生物還可用于食品行業(yè)中的增稠劑和食品添加 劑[5]。但甲殼素的分子具有非常穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，分子間和分子內(nèi)存在較強(qiáng)的氫鍵作用，使得甲殼素形成高度的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使其溶解性能差，不易溶于水、稀酸稀堿和常規(guī)的有機(jī)溶劑中[1，3]，嚴(yán)重限制了它的發(fā)展與應(yīng)用。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國90%以上甲殼素用于酸水解制造氨糖，但氨糖不屬于我國的原料藥，因此80%以上產(chǎn)品主要出口至國外。然而，國際市場氨糖價(jià)格降低至10 萬元/噸以下，同時(shí)隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，目前國內(nèi)氨糖已可通過生物法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，而且生物法價(jià)格低廉，導(dǎo)致氨糖價(jià)格持續(xù)走低；另外，隨著環(huán)保問題日益受到重視，環(huán)境污染治理成本提高，很多廠家開始減少生產(chǎn)。未來甲殼素加工將面臨新一輪的難題，必須尋找新的突破。將甲殼素進(jìn)行低成本利用、建立一種綠色工藝，不僅有利于將廢棄資源變廢為寶、對環(huán)境友好，而且具有潛在的經(jīng)濟(jì)效益和良好的研究價(jià)值。

對甲殼素進(jìn)行修飾、改性，將極大的拓展甲殼素的應(yīng)用范圍；而對甲殼素表面進(jìn)行脫乙酰活化是其中最重要的方式之一。經(jīng)表面脫乙酰修飾的甲殼素可溶于稀酸，具有良好的吸附性和通透性等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還保留了甲殼素的結(jié)構(gòu)框架，因此具備了更加廣闊的應(yīng)用前景。

腈水解酶是工業(yè)生物催化中的一種關(guān)鍵酶類，可一步催化腈類化合物生成有機(jī)酸及氨基酸等，該反應(yīng)條件溫和、催化效率高、綠色環(huán)保，從而在化工、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用[6-7]。然而，從已有文獻(xiàn)資料來看，腈水解酶的實(shí)際應(yīng)用仍受到穩(wěn)定性不夠高、催化劑的重復(fù)利用批次較差等因素的限制；由于具有改善穩(wěn)定性、提高重復(fù)利用率、緩解細(xì)胞自身裂解等優(yōu)勢，固定化技術(shù)的出現(xiàn)可彌補(bǔ)上述腈水解酶應(yīng)用中的缺陷[8-10]。另外，傳統(tǒng)研究主要采用細(xì)菌來源的腈水解酶為催化劑，而有關(guān)真菌腈水解酶則相對研究較少，而且據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，真菌腈水解酶在選擇性和底物譜等方面相比細(xì)菌腈水解酶具有一定優(yōu)勢[11]。

本工作嘗試采用經(jīng)表面活化的甲殼素廢棄物用于固定產(chǎn)腈水解酶的真菌Gibberella intermedia，進(jìn)行4-氰基吡啶的生物轉(zhuǎn)化以制備異煙酸。近年來有關(guān)修飾改性甲殼素的研究主要集中于其對重金屬和有毒有害化合物的吸附功能[3，12-13]，而采用表面活化改性的甲殼素固定產(chǎn)酶細(xì)胞則鮮有研究，利用該固定化腈水解酶催化劑制備有機(jī)酸尚屬首次報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

立式離心機(jī)，日本HITACHI 公司；UV-2100紫外分光光度計(jì)，上海UNICO 儀器有限公司；高壓滅菌鍋，日本三洋公司；DK-8D 型電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海博訊醫(yī)療儀器有限公司；甲殼素制備原料由揚(yáng)州日興生物科技股份有限公司提供；4-氰基吡啶、異煙酸和異煙酰胺為分析純，購自阿拉丁試劑公司；酵母粉和胰蛋白胨，由Oxoid 公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 菌種培養(yǎng)

產(chǎn)腈水解酶真菌G. intermedia 由本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得[14]，已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4903。將斜面上的菌種接種至種子培養(yǎng)基，30℃、200r/min條件下培養(yǎng)36h；再將新鮮的種子轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、200r/min 培養(yǎng)60h。離心收集菌體 備用。

種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖30，硝酸鈉3，磷酸氫二鉀1，硫酸鎂0.5，氯化鉀0.5，硫酸亞鐵0.01；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，酵母粉7.5，磷酸二氫鉀2.72，硫酸亞鐵0.014，氯化鈉1.16，己內(nèi)酰胺3.39，pH 值 7.0。

1.3 表面活化甲殼素制備

將蛋白酶處理過的蝦殼用水洗滌3 次、過濾、烘干備用；采用4%的鹽酸對預(yù)處理樣品進(jìn)行脫鈣處理，隨后將樣品洗滌至中性；在微波（高火）條件下，采用40%氫氧化鈉溶液對其進(jìn)行脫乙酰，微波處理時(shí)間30min，此時(shí)脫乙酰度達(dá)到約80%，隨后水洗至中性，收集濾渣108℃烘干至恒重；用密封式粉碎機(jī)將樣品粉碎成60～150 目左右細(xì)粉 備用。

1.4 固定化細(xì)胞制備

收集培養(yǎng)獲得的絮狀菌體制成菌懸液，將用2%乙酸溶液溶解的表面活化甲殼素，與一定濃度的菌液均勻混合。利用帶有針頭的醫(yī)用注射器穩(wěn)定地將混合液滴入到不同濃度的三聚磷酸鈉溶液中固化成球。在4℃條件下固化4h。采用pH 值7.0 的磷酸鈉緩沖液（10mmol/L）洗滌固定化細(xì)胞至中性后分別測定酶活，在確定最優(yōu)的甲殼素濃度、三聚磷酸鈉濃度及菌體濃度后，優(yōu)化固定化時(shí)間。

1.5 固定化細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化

以4-氰基吡啶為底物，固定化細(xì)胞為催化劑，進(jìn)行固定化和游離細(xì)胞合成異煙酸的生物轉(zhuǎn)化過程研究。將反應(yīng)體系中各組分分別置于30℃下溫浴10min 后轉(zhuǎn)入錐形瓶中，轉(zhuǎn)化反應(yīng)在30℃旋轉(zhuǎn)式搖床上進(jìn)行，用2mol/L HCl 終止反應(yīng)，取一定量轉(zhuǎn)化液進(jìn)行酶活檢測。該腈化合物轉(zhuǎn)化過程中，產(chǎn)物酸與氨是1∶1 生成。一個(gè)酶活單位的定義為：在測定條件下，1min 時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化生成1μmol 氨所對應(yīng)的酶量為1U。

1.6 檢測方法

氨含量檢測方法：采用苯酚-次氯酸鈉法[15]。根據(jù)堿性條件下亞硝基鐵氰化鈉可催化氨與苯酚和次氯酸鈉反應(yīng)生成藍(lán)色可溶性物質(zhì)的特點(diǎn)，通過紫外分光光度法測定該藍(lán)色物質(zhì)。在反應(yīng)液中依次加入苯酚鈉溶液2.0mL、亞硝基鐵氰化鈉和次氯酸鈉溶液各3.0mL，用除氨水定容至10mL，充分搖勻后置于27℃水浴中反應(yīng)15min，取出后于630nm 處測定其吸收值。

底物及產(chǎn)物的HPLC 檢測方法：色譜柱為Atlantis dC 18 柱，5.0μm，150mm×4.6mm；流動(dòng)相為甲醇/0.01%磷酸（體積比5∶95）；波長268nm；柱溫30℃；流速0.7mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化過程各因素對細(xì)胞酶活的影響

2.1.1 甲殼素濃度對固定化細(xì)胞酶活的影響

當(dāng)經(jīng)表面活化的甲殼素濃度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）為3%時(shí)比酶活達(dá)到最高，提高或降低濃度均導(dǎo)致比酶活降低[圖1(a)]?？赡苡捎诩讱に氐氖褂脻舛仍礁撸浞肿映恋硇纬傻墓袒ぴ街旅?，且固化速度過快容易出現(xiàn)拖尾，底物分子進(jìn)出細(xì)胞難度增加，故酶活降低；另一方面，當(dāng)甲殼素濃度過低時(shí)它與凝結(jié)劑三聚磷酸鈉的接觸無法形成穩(wěn)定的固化膜，不能得到高質(zhì)量、高機(jī)械強(qiáng)度的固定化細(xì)胞。

圖1 甲殼素濃度、三聚磷酸鈉濃度、固定化時(shí)間和菌體濃度對固定化細(xì)胞酶活的影響

2.1.2 三聚磷酸鈉濃度對酶活的影響

三聚磷酸鈉濃度影響凝結(jié)液的pH 值和陰離子濃度，從而影響固定化小球的形成速度和穩(wěn)定性。在低濃度三聚磷酸鈉溶液中，固定化小球生成速度慢，所制得小球機(jī)械強(qiáng)度差，易變形、破碎；不過隨著三聚磷酸鈉濃度提高，小球生成速度加快，產(chǎn)品機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性提高。但三聚磷酸鈉濃度過高則會(huì)導(dǎo)致小球生成速度過快，不能形成完全的孔膜，小球呈橢圓形，有氣孔，機(jī)械強(qiáng)度差。由圖1(b)可知，三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)由4%升高到7%時(shí)，固定化細(xì)胞的比酶活逐漸提高，三聚磷酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升至12%時(shí)，比酶活則開始逐漸降低。最終選擇7%三聚磷酸鈉為固定化細(xì)胞的最適凝結(jié)劑濃度。

2.1.3 固定時(shí)間對酶活的影響

固定時(shí)間對固定化細(xì)胞酶活的影響如圖1(c)所示。固化時(shí)間太短，所形成的固化膜結(jié)構(gòu)松散，固定化小球機(jī)械強(qiáng)度差，細(xì)胞逃逸量較大。當(dāng)固化時(shí)間為5h 時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，固化膜致密程度適中，固定化細(xì)胞具有最大酶活。因此選擇固定化細(xì)胞的最佳固定時(shí)間為5h。

2.1.4 菌體包埋量的選擇

催化劑在固定化細(xì)胞體系中的含量將直接影響其催化反應(yīng)速率。如圖1(d)所示，在所采用的細(xì)胞濃度由6g/L 提高至20g/L 的范圍內(nèi)，隨細(xì)胞濃度增加酶活也相應(yīng)提高。但當(dāng)菌體濃度從20g/L 增加到24g/L 時(shí)，比酶活卻隨著菌體加入量的增加而減小，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能歸于活細(xì)胞間對營養(yǎng)物質(zhì)的相互競爭所造成的[16]。故綜合考慮，將該體系的菌體濃度確立為20g/L。

2.2 固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程各因素對細(xì)胞酶活的 影響

2.2.1 溫度對酶活的影響

采用上述條件制備的固定化細(xì)胞用于4-氰基吡啶的生物轉(zhuǎn)化。首先考察了溫度對固定化細(xì)胞酶活力的影響。一般溫度的影響主要分兩方面：在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高，酶活力提高；但當(dāng)溫度繼續(xù)升高酶則逐漸變性失活，反應(yīng)速率下降。

圖2(a)為溫度對甲殼素固定化細(xì)胞酶活的影響。結(jié)果顯示固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)溫度為50℃；而實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn)相應(yīng)游離細(xì)胞最適反應(yīng)溫度為40℃[14]。隨著反應(yīng)溫度升高，酶促反應(yīng)速率加快，但酶蛋白也會(huì)失活變性，使得酶活力降低。

2.2.2 轉(zhuǎn)化pH 值對酶活的影響

圖2 轉(zhuǎn)化溫度和pH 值對固定化細(xì)胞酶活的影響

微生物酶均在一定的pH 值條件下才顯示出最佳反應(yīng)活性，當(dāng)高于或低于此pH 值時(shí)酶活都會(huì)受影響而活力降低。酶活力受pH 值變化影響的原因是，當(dāng)pH 值發(fā)生微小偏移，酶活性部位的基團(tuán)離 子發(fā)生變化而導(dǎo)致酶活降低；pH 值發(fā)生較大偏移的時(shí)候，會(huì)導(dǎo)致酶蛋白的變性。目前，生物催化反應(yīng)多數(shù)在中性環(huán)境中進(jìn)行，在此條件下催化反應(yīng)速率一般能達(dá)到最大值。如圖2(b)所示，固定化細(xì)胞的最適反應(yīng)pH 值為7.0；游離細(xì)胞的最適反應(yīng)pH 值為7.6[14]，基本保持穩(wěn)定。固定化細(xì)胞酶活隨pH值變化趨勢較緩，說明甲殼素固定化對細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)室前期還嘗試過采用殼聚糖-聚乙烯醇復(fù)合材料進(jìn)行G.intermedia固定化，結(jié)果表明固定化細(xì)胞最適反應(yīng)溫度和pH 值分別為45℃和7.0[17]。與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.2.3 底物濃度對酶活的影響

底物濃度能夠顯著影響底物轉(zhuǎn)化速率和細(xì)胞酶活力，尤其對于腈化合物這類對細(xì)胞有毒性的底物。在酶濃度恒定條件下，當(dāng)?shù)孜餄舛容^小時(shí)，酶未被底物飽和，這時(shí)反應(yīng)速率取決于底物濃度；隨著底物濃度增加，中間復(fù)合物生成也越多，而反應(yīng)速率取決于中間復(fù)合物的濃度，故反應(yīng)速率也隨之增高。當(dāng)溶液中的酶全部被底物飽和，溶液中無多余的酶，盡管提高底物濃度也不會(huì)再有更多的中間復(fù)合物生成，這時(shí)反應(yīng)速率達(dá)到最大。但當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時(shí)會(huì)對酶產(chǎn)生抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[圖3(a)]，固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化選取底物濃度為125mmol/L 時(shí)酶活最高，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?25～200mmol/L 時(shí)，酶活雖有所降低，但降低幅度較緩慢。而游離細(xì)胞在低于50mmol/L 底物濃度時(shí)具有較高酶活，當(dāng)濃度高于50mmol/L，游離細(xì)胞的酶活受到抑制，而200mmol/L 底物甚至使游離細(xì)胞酶活幾乎喪失[14]?？梢钥闯黾讱に氐墓潭▽w具有保護(hù)作用，使催化劑的底物耐受性有顯著提高。G. intermedia 復(fù)合固定化細(xì)胞的最適轉(zhuǎn)化底物濃度為300mmol/L[17]，相比甲殼素固定化細(xì)胞有進(jìn)一步提高。因此后續(xù)研究將繼續(xù)摸索該固定化工藝以期進(jìn)一步改善甲殼素固定化細(xì)胞的催化潛力。

圖3 底物濃度和產(chǎn)物濃度對固定化細(xì)胞酶活的影響

2.2.4 產(chǎn)物濃度對酶活的影響

產(chǎn)物酸的高濃度及所造成的pH 值環(huán)境對于轉(zhuǎn)化反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行具有一定抑制作用。因此本研究考察了產(chǎn)物異煙酸的濃度對酶活的影響，分別選取50～600mmol/L 產(chǎn)物濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖3(b)可知，固定化細(xì)胞在產(chǎn)物濃度小于400mmol/L 時(shí)，酶活基本保持穩(wěn)定，且有小幅度提升。而游離細(xì)胞在高于150mmol/L 濃度時(shí)酶活則快速降低。這可能歸因于在固定化細(xì)胞中，產(chǎn)物濃度增加后，細(xì)胞的通透性增強(qiáng)，促進(jìn)了底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散，使酶催化速率提升。雖然產(chǎn)物對酶有抑制作用，但細(xì)胞的通透性增強(qiáng)的效果略大于產(chǎn)物對酶的抑制效應(yīng)，所以酶活也有一定上升。但當(dāng)產(chǎn)物濃度繼續(xù)增大時(shí)，抑制作用增強(qiáng)，酶迅速失活。

2.2.5 重復(fù)利用批次對底物轉(zhuǎn)化率的影響

在以上優(yōu)化的最適條件下，以125mmol/L 4-氰基吡啶為底物，比較固定化細(xì)胞和游離細(xì)胞對底物4-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化過程。如圖4(a)所示，游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞分別在100min 和80min 內(nèi)將底物轉(zhuǎn)化完全，并生成相應(yīng)的異煙酸，同時(shí)反應(yīng)體系中會(huì)檢測到微量的異煙酰胺同時(shí)生成。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行批次轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。如圖4(b)所示，固定化細(xì)胞可以重復(fù)利用14 個(gè)批次，菌體轉(zhuǎn)化能力為45.5g(4-氰基吡啶)/g(dcw)；而游離細(xì)胞可重復(fù)利用3 個(gè)批次，菌體轉(zhuǎn)化能力為9.75g(4-氰基吡啶)/g(dcw)。這充分證明固定化細(xì)胞具有良好的穩(wěn)定性。不過在轉(zhuǎn)化后期，固定化小球不斷吸水膨脹，會(huì)出現(xiàn)少部分破碎。

圖4 4-氰基吡啶的轉(zhuǎn)化過程及批次轉(zhuǎn)化

3 結(jié) 論

異煙酸是合成抗結(jié)核病藥物的重要中間體，在醫(yī)藥化工等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用。傳統(tǒng)研究主要采用化學(xué)方法進(jìn)行合成；由于具備反應(yīng)條件溫和、催化特異性高等特點(diǎn)，采用腈水解酶介導(dǎo)的生物催化合成途徑近年來逐步受到重視。但目前已報(bào)道的對4-氰基吡啶具有高特異性的產(chǎn)腈水解酶菌株仍非常有限，而且主要集中于細(xì)菌來源的菌株。本研究采用實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得的一株對4-氰基吡啶轉(zhuǎn)化效率較高的真菌G. intermedia 為催化劑，首次嘗試通過表面活化的甲殼素為包埋材料對游離細(xì)胞進(jìn)行固定化，優(yōu)化了固定化過程的基本參數(shù)，并將制備的固定化細(xì)胞應(yīng)用于4-氰基吡啶生物轉(zhuǎn)化合成異煙酸。甲殼素及其衍生物主要來源于蝦蟹等海產(chǎn)品的外殼，來源豐富、而且具有生物安全性，本研究針對廢棄生物質(zhì)資源高效利用，拓展了工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物質(zhì)的資源化領(lǐng)域，并為異煙酸的規(guī)?；锖铣傻於嘶A(chǔ)；具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和理論意義。

[1] 蔣小姝，莫海濤，蘇海佳，等. 甲殼素及殼聚糖在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域方面的應(yīng)用[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（6）：170-174.

[2] 張群. 甲殼生物質(zhì)資源生態(tài)高值加工關(guān)鍵技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，33（3）：336.

[3] Huang C-M，Chen L-C，Yang H-C，et al. Preparation of acrylic acid-modified chitin improved by an experimental design and its application in absorbing toxic organic compounds[J]. J. Hazard Mater.，2012，241-242：190-196.

[4] 趙云強(qiáng)，方伊. 甲殼素、殼聚糖的綜合應(yīng)用及其發(fā)展前景[J]. 貴州化工，2001，26（1）：10-13.

[5] 蘇廣宇，劉四新，李從發(fā). 甲殼素/殼聚糖的研究與應(yīng)用概況[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，2：107-111.

[6] Gong J-S，Lu Z-M，Li H，et al. Nitrilases in nitrile biocatalysis：Recent progress and forthcoming research[J]. Microb. Cell Fact.，2012，11：142.

[7] Martínková L，K?en V. Biotransformations with nitrilases[J]. Curr. Opin. Chem. Biol.，2010，14（2）：130-137.

[8] Ni K，Wang H，Zhao L，et al. Efficient production of（R）-（-）-mandelic acid in biphasic system by immobilized recombinant E. coli[J]. J. Biotechnol.，2013，167（4）：433-440.

[9] Pawar S，Meena V，Kaushik S，et al. Stereo-selective conversion of mandelonitrile to（R）-（-）-mandelic acid using immobilized cells of recombinant Escherichia coli[J]. 3 Biotech.，2012，2：319-326.

[10] Gong J-S，Lu Z-M，Li H，et al. Metagenomic technology and genome mining：Emerging areas for exploring novel nitrilases[J]. Appl. Microbiol. Biotechnol.，2013，97（15）：6603-6611.

[11] Vejvoda V，Kubác D，Davidová A，et al. Purification and characterization of nitrilase from Fusarium solani IMI196840[J]. Process Biochem.，2010，45（7）：1115-1120.

[12] Kousalya G N，Gandhi M R，Meenakshi S. Preparation of modified chitin for the removal of chromium(Ⅵ)[J]. Bioremediat. J.，2010，14（4）：208-218.

[13] Yong S K，Bolan N S，Lombi E，et al. Sulfur-containing chitin and chitosan derivatives as trace metal adsorbents：A review[J]. Crit. Rev. Env. Sci. Technol.，2012，43（16）：1741-1794.

[14] Wu Y，Gong J-S，Lu Z-M，et al. Isolation and characterization of Gibberella intermedia CA3-1，a novel and versatile nitrilase- producing fungus[J]. J. Basic Microbiol.，2013，53（11）：934-941.

[15] Gong J-S，Lu Z-M，Shi J-S，et al. Isolation，identification，and culture optimization of a novel glycinonitrile - hydrolyzing fungus—— Fusarium oxysporum H3[J]. Appl. Biochem. Biotechnol.，2011，165（3）：963-977.

[16] Hegge AB，Andersen T，Melvik JE，et al. Formulation and bacterial phototoxicity of curcumin loaded alginate foams for wound treatment applications：Studies on curcumin and curcuminoides XLII[J]. J. Pharm. Sci.，2011，100（1）：174-185.

[17] 楊濤，李恒，龔勁松，等. 固定化Gibberella intermedia 轉(zhuǎn)化3-氰基吡啶制備煙酸[J]. 化工進(jìn)展，2014，33（9）：2432-2437.