高小玲，崔姍姍，汪保英，王慧慧，陳玉龍

旋覆歸連方是本課題組結(jié)合大量食管癌相關(guān)文獻(xiàn)和應(yīng)用抗腫瘤體外模型進(jìn)行藥物篩選，立足于理氣祛痰、活血化瘀、清熱解毒的治療原則，將多法合于一方總結(jié)出來的［1-3］。方中旋覆花具有降氣止嘔、消痰散結(jié)、通利血脈之功效，在本方中作為君藥;當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便、下氣止咳之作用［4-5］;黃連具有瀉火解毒、清熱燥濕之功能［6］。三藥配合，共湊降氣化痰活瘀、清熱解毒散結(jié)、抑瘤生長之功能。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方能夠明顯抑制食管癌細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并能夠阻滯腫瘤細(xì)胞周期，可將食管癌ECa9706細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期［7］。疼痛、炎性增生等是腫瘤患者的常見癥狀。為了探討旋覆歸連方的藥理作用，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)觀察旋覆歸連方醇提液鎮(zhèn)痛及抗感染作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 昆明小鼠240只，SPF級(jí)，6～8周齡，雌150只、雄90只，體質(zhì)量18～22 g，購自山東魯抗醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，許可證號(hào):SCXK(魯)20130001，在河南中醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.2 試驗(yàn)藥物 旋覆花、當(dāng)歸、黃連購自河南中醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，由本實(shí)驗(yàn)室提取有效部位并按旋覆花∶當(dāng)歸∶黃連=9∶6∶5比例，加入10倍85%乙醇，1周后取藥液，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，所得浸膏充分蒸發(fā)水分后稱重。實(shí)驗(yàn)時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉配成所需濃度。阿司匹林:西安利君制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H61021710;醋酸地塞米松片:浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)140301。

1.3 熱板致痛作用 雌性小鼠置于 (55.0±0.5)℃智能熱板儀中，自投入熱板至出現(xiàn)舔后足時(shí)間為其痛閾，取痛閾為5～30 s的小鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，空白對(duì)照組(羧甲基纖維素鈉)、阿司匹林組 (阿司匹林溶液 0.2 g·kg-1·d-1，0.01 g/ml)、旋覆歸連方低劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。測定正常痛閾后，各組以不同藥物0.2 ml/10 g分別連續(xù)灌胃4 d。于給藥前和末次給藥后30 min、1 h、2 h分別測小鼠痛閾1次［8］。

1.4 冰乙酸致痛作用 剩余小鼠隨機(jī)選取60只，雌雄各半，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，空白對(duì)照組 (羧甲基纖維素鈉)、阿司匹林組 (阿司匹林溶液 0.2 g·kg-1·d-1，0.01 g/ml)、旋覆歸連方低劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。各組以不同藥物0.2 ml/10 g分別連續(xù)灌胃4 d，末次給藥后1 h腹腔注射0.6%冰乙酸氯化鈉溶液0.2 ml，記錄20 min 內(nèi)小鼠扭體次數(shù)［5］。

1.5 耳郭二甲苯致炎作用 剩余小鼠隨機(jī)選取60只，雌雄各半，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，空白對(duì)照組 (羧甲基纖維素鈉)、地塞米松組 (地塞米松0.02 g·kg-1·d-1)、旋覆歸連方低劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。各組以不同藥物0.2 ml/10 g分別連續(xù)灌胃4 d，最后1次于實(shí)驗(yàn)前1 h灌胃。實(shí)驗(yàn)時(shí)將60 μl二甲苯均勻涂于小鼠右耳兩面致炎，左耳做對(duì)照，20 min后處死小鼠，用直徑7 mm的打孔器將小鼠雙耳同部位等面積切下，用電子天平稱重，以左右耳質(zhì)量之差為耳郭腫脹度［9］。

1.6 肉芽腫組織凈質(zhì)量 剩余小鼠60只，雌雄各半。采用10%水合氯醛0.38 g/kg腹腔注射麻醉，左右腋窩各放入質(zhì)量為10 mg的經(jīng)高壓滅菌棉球，縫合切口。術(shù)后第2天，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，空白對(duì)照組 (羧甲基纖維素鈉)、地塞米松組 (地塞米松0.02 g·kg-1·d-1)、旋覆歸連方低劑量組(旋覆歸連方醇提液0.45 g/kg)、旋覆歸連方中劑量組 (旋覆歸連方醇提液0.90 g/kg)、旋覆歸連方高劑量組 (旋覆歸連方醇提液1.80 g/kg)，每組12只。各組連續(xù)灌胃8 d后處死小鼠，取出兩側(cè)的棉球及肉芽腫組織，于80℃烘箱烘2 h，取出棉球后稱重，除以2即為一側(cè)平均肉芽腫組織質(zhì)量，此質(zhì)量與植入時(shí)棉球質(zhì)量之差即為肉芽腫組織凈質(zhì)量［9］。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，不同時(shí)間痛閾比較采用兩因素重復(fù)測量方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠不同時(shí)間痛閾比較 痛閾治療方法與時(shí)間無交互作用 (P＞0.05);組間痛閾比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);不同時(shí)間痛閾比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

2.2 各組小鼠扭體次數(shù)比較 5組小鼠扭體次數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。與空白對(duì)照組比較，阿司匹林組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);與阿司匹林組比較，旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠扭體次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);與旋覆歸連方中劑量組比較，旋覆歸連方高劑量組小鼠扭體次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表2)。

表1 各組小鼠不同時(shí)間痛閾比較 (±s，s)Table 1 Comparison of pain threshold in different time among different groups of mice

表1 各組小鼠不同時(shí)間痛閾比較 (±s，s)Table 1 Comparison of pain threshold in different time among different groups of mice

注:○部分小鼠死亡

組別 只數(shù)○ 給藥前 給藥后30 min給藥后1 h 給藥后12 18.8 ±4.6 20.3 ±5.3 17.2 ±7.6 24.0 ±8.2阿司匹林組 10 18.2 ±5.2 21.5 ±6.4 27.1 ±5.3 35.2 ±8.9旋覆歸連方低劑量組 11 17.3 ±6.8 24.4 ±5.0 23.5 ±6.7 28.6 ±8.7旋覆歸連方中劑量組 12 16.8 ±4.2 18.4 ±4.4 28.5 ±7.0 22.6 ±7.5旋覆歸連方高劑量組 11 16.4 ±4.2 18.4 ±6.1 19.0 ±5.4 26.2 ±9.0 F 2 h空白對(duì)照組值=0.001 F交互 =1.212，F(xiàn)組間 =1.062，F(xiàn)時(shí)間 =4.759 P 值 P交互 =0.283，P組間 =0.388，P時(shí)間

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較 (±s，次)Table 2 Comparison of writhing times among different groups of mice

表2 各組小鼠扭體次數(shù)比較 (±s，次)Table 2 Comparison of writhing times among different groups of mice

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;與阿司匹林組比較，△P＜0.05;與旋覆歸連方中劑量組比較，▲P＜0.05;○部分小鼠死亡

組別 只數(shù)○ 扭體次數(shù)12 30.8 ±7.3阿司匹林組 11 2.2 ±1.0*旋覆歸連方低劑量組 11 13.3 ±6.0＊△旋覆歸連方中劑量組 12 17.3 ±4.0＊△旋覆歸連方高劑量組 12 9.1 ±3.4＊△▲F空白對(duì)照組＜0.001 55.850 P值值

2.3 各組小鼠耳郭腫脹度比較 5組小鼠耳郭腫脹度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。地塞米松組耳郭腫脹度較空白對(duì)照組減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);空白對(duì)照組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠耳郭腫脹度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表3)。

表3 各組小鼠耳郭腫脹度比較 (±s，mg)Table 3 Comparison of auricle swelling degree among different groups of mice

表3 各組小鼠耳郭腫脹度比較 (±s，mg)Table 3 Comparison of auricle swelling degree among different groups of mice

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05

12 17.2 ±6.2地塞米松組 12 9.1 ±4.2*旋覆歸連方低劑量組 12 11.6 ±5.7旋覆歸連方中劑量組 12 14.9 ±6.5旋覆歸連方高劑量組 12 14.2 ±6.4 F組別 只數(shù) 腫脹度空白對(duì)照組2.710 P值值0.039

2.4 各組小鼠肉芽腫組織凈質(zhì)量比較 5組小鼠肉芽腫組織凈質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。與空白對(duì)照組比較，地塞米松組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠肉芽腫組織凈質(zhì)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);地塞米松組、旋覆歸連方低劑量組、旋覆歸連方中劑量組、旋覆歸連方高劑量組小鼠肉芽腫組織凈質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表4)。

表4 各組小鼠肉芽腫組織凈質(zhì)量比較 (±s，mg)Table 4 Comparison of net weight of granuloma among different groups of mice

表4 各組小鼠肉芽腫組織凈質(zhì)量比較 (±s，mg)Table 4 Comparison of net weight of granuloma among different groups of mice

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05;○部分小鼠死亡

組別 只數(shù)○10 30.1 ±11.2地塞米松組 10 17.4 ± 6.5*旋覆歸連方低劑量組 10 19.4± 7.8*旋覆歸連方中劑量組 9 18.0± 7.0*旋覆歸連方高劑量組 10 18.4± 6.6*F肉芽腫凈質(zhì)量空白對(duì)照組4.370 P值值0.005

3 討論

炎癥為常見病理變化，疼痛是炎癥的常見癥狀，也是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要因素。旋覆花的活性內(nèi)酯具有抗感染、抗腫瘤等藥理作用［10］，當(dāng)歸有效成分揮發(fā)油、有機(jī)酸、碳水化合物、氨基酸以及黃連主要成分黃連素等，在炎癥、腫瘤以及疼痛研究中療效肯定［11-12］。旋覆歸連方是本課題組經(jīng)過對(duì)腫瘤細(xì)胞的篩選及基于中藥理論所組的方劑，并已取得國家發(fā)明專利 (專利號(hào):ZL201210131821.X)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，旋覆歸連方85%醇提液所得提取物對(duì)食管癌細(xì)胞的抑制作用比較穩(wěn)定［13］。本實(shí)驗(yàn)從鎮(zhèn)痛、抗感染方面考察旋覆歸連方醇提液的作用，為該方體外應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，不同時(shí)間間痛閾比較有差異。由于熱板反復(fù)檢測小鼠痛閾，小鼠短時(shí)間內(nèi)容易產(chǎn)生適應(yīng)性，因此組內(nèi)結(jié)果差異不大，而阿司匹林組在此實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果也不明顯，可能因?yàn)榘⑺酒チ指m于慢性鈍痛。旋覆歸連方醇提液可減少冰乙酸所致小鼠扭體次數(shù)，表明旋覆歸連方對(duì)冰乙酸所致慢性鈍痛有一定的作用。旋覆歸連方醇提液可降低小鼠皮下包埋棉球引起的慢性肉芽腫反應(yīng)，與食管癌臨床治療的適應(yīng)證相符，表明該方具有良好的抗感染作用。值得注意的是其對(duì)慢性肉芽腫治療作用明顯，旋覆歸連方低劑量組與地塞米松組無差異。

慢性肉芽腫主要病理成分為上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，血管生成明顯，且白介素 (IL)-8高表達(dá)并發(fā)揮重要病理作用。IL-8是影響反流性胃食管疾病中食管上皮遷移、纖維化和癌變的重要炎性遞質(zhì)［14］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，旋覆歸連方對(duì)細(xì)胞周期信號(hào)通路相關(guān)基因、蛋白激酶 (AKT1)、核因子(NF)-κB、絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK)-9及多個(gè)炎癥相關(guān)基因表達(dá)具有很好的抑制作用，其中用藥組IL-8表達(dá)明顯下降［13］。IL-8及其受體在食管鱗癌患者血清及組織中呈高表達(dá)，并與腫瘤分期、預(yù)后，特別是淋巴和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為預(yù)測腫瘤結(jié)果和選擇相應(yīng)治療方法的潛在標(biāo)志物［15-16］。

綜上所述，腫瘤與慢性炎癥關(guān)系密切，本實(shí)驗(yàn)旋覆歸連方醇提液鎮(zhèn)痛和抗感染療效顯著，該方是否通過IL-8信號(hào)調(diào)控腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境而起到止痛抗感染及抗腫瘤作用，將在下一步進(jìn)行研究。

［1］ Zhou L，Hong SL，Chen YL.Effects of Chinese herbs on tumor angiogenesis［J］.China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2013，11(28):1619-1622.(in Chinese)

周凌，洪素蘭，陳玉龍.中醫(yī)藥對(duì)腫瘤血管生成的影響［J］.中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，11(28):1619-1622.

［2］ Chen YL，Miao YY，Si FC.Comparative study on inhibitory effect of reinforcing spleen and stomach recipes on tumour growth ［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2010，16(3):112-115.(in Chinese)

陳玉龍，苗艷艷，司富春.健脾和胃類方對(duì)腫瘤細(xì)胞生長抑制的比較研究 ［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(3):112-115.

［3］陳玉龍，司富春.中醫(yī)藥治療食道癌方藥分析［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):401-402.

［4］李婭玲，翟新貴，王喜梅.復(fù)方當(dāng)歸注射液治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效觀察 ［J］.中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2012，15(7):1026-1027.

［5］曾令渠，唐霞.當(dāng)歸四逆湯臨證心得 (附三例報(bào)告)［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2010，18(5):625.

［6］孫永琦.雙黃連粉針劑治療病毒性心肌炎的療效觀察［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2011，19(8):1381.

［7］ Ma JH，Chen YL，Wang HB，et al.The relationship between inhibitory effect of Xuanfuguilian prescription on the growth of esophageal cells ECA9706 and its components［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2013，36(2):265-271.(in Chinese)

馬俊華，陳玉龍，王海波，等.旋覆歸連方抑制食管癌細(xì)胞ECA9706生長作用與組分關(guān)系分析 ［J］.中藥材，2013，36(2):265-271.

［8］ Li D，Wu YS，Wang C，et al.Pharmacokinetics research on antiinflammatory effect and analgesic effect of indigo naturalis［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2011，17(13):137-140.(in Chinese)

李東，武彥舒，王燦，等.青黛鎮(zhèn)痛、抗炎藥效學(xué)研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(13):137-140.

［9］ WangM，ChenJR，SongCR，et al.Analgesicandantiinflammatory effect of prepared rhei radix et rhizoma with wine ［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2013，19(5):255-257.(in Chinese)

王梅，陳俊榮，宋翠榮，等.酒大黃的鎮(zhèn)痛抗炎作用［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(5):255-257.

［10］ Zhu H，Tang SA，Qin N，et al.Anti-inflammatory constituents from inula japonica ［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2014，39(1):83-88.(in Chinese)

朱虹，唐生安，秦楠，等.旋覆花中化學(xué)成分及其活性研究［J］.中國中藥雜志，2014，39(1):83-88.

［11］ Li M，Li HF，Cui WL，et al.Progress research of angelica main chemicalcomposition and the antiviral，anti- inflammatory pharmacological［J］.Shandong Journal of Traditional Chinese Medicine，2013，32(9):694-695.(in Chinese)

李明，李慧芬，崔偉亮，等.當(dāng)歸主要化學(xué)成分及抗病毒、抗炎藥理作用研究進(jìn)展 ［J］.山東中醫(yī)雜志，2013，32(9):694-695.

［12］ Feng YB，Luo WQ，Zhu SQ.Explore new clinical application of Huanglian and corresponding compound prescription from their traditional use ［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2008，33(10):1221-1225.(in Chinese)

馮奕斌，羅偉權(quán)，朱世清.從黃連及其復(fù)方古今臨床應(yīng)用，發(fā)掘現(xiàn)代臨床新應(yīng)用 ［J］.中國中藥雜志，2008，33(10):1221-1225.

［13］馬俊華.基于痰瘀毒病機(jī)所組旋覆歸連方抑制食管癌細(xì)胞生長機(jī)制的研究［D］.鄭州:河南中醫(yī)學(xué)院，2013.

［14］ Kim JH，F(xiàn)rantz AM，Anderson KL，et al.Interleukin-8 promotes canine hemangiosarcoma growth by regulating the tumor microenvironment［J］.Exp Cell Res，2014，323(1):155-164.

［15］ Rieder F，Biancani P，Harnett K，et al.Inflammatory mediators in gastroesophageal refluxdisease:impacton esophagealmotility，fibrosis，and carcinogenesis［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physio，2010，298(5):G571-581.

［16］ Ogura M，Takeuchi H，Kawakubo H，et al.Clinical significance of CXCL-8/CXCR-2 network in esophageal squamous cell carcinoma［J］.Surgery，2013，154(3):512-520.