曹國(guó)慶，李秀華，武百山，倪家驤

臭氧可改善氧氣供應(yīng)，增強(qiáng)免疫，釋放血紅素氧合酶1(HO-1)、熱休克蛋白70(HSP-70)，產(chǎn)生超級(jí)紅細(xì)胞，釋放干細(xì)胞，上調(diào)抗氧化酶［1-2］。臭氧自體血治療是補(bǔ)充性的臨床治療方法，已應(yīng)用于乙型肝炎、糖尿病、退行性眼病、不同疼痛綜合征和缺血性外周血管病的治療［3］。前期的臨床研究顯示，臭氧自體血治療可以有效緩解痛風(fēng)患者的疼痛，具有鎮(zhèn)痛作用，且患者耐受性良好、安全、沒(méi)有嚴(yán)重不良反應(yīng)［4］。本研究旨在觀察痛風(fēng)患者經(jīng)臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白水平及炎性細(xì)胞因子水平的改變，在細(xì)胞水平上研究探討其可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例入選與排除標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn):符合2006年歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟 (EULAR)診斷痛風(fēng)標(biāo)準(zhǔn)［4］，尿酸＞420 μmol/L;急性或慢性痛風(fēng)男性患者，年齡20～60歲;痛風(fēng)藥物治療效果不佳或產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng);藥物治療有禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn):不同意臭氧自體血治療;患心理精神疾病;葡萄糖-6-磷酸脫氫酶 (G-6PD)明顯缺陷;嚴(yán)重的過(guò)敏體質(zhì);應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療;患甲狀腺功能亢進(jìn)癥、血小板減少癥和嚴(yán)重心血管疾病;嚴(yán)重腎功能損害 (血漿肌酐清除率＜30 ml/min)。

1.2 一般資料 選擇2012年6月—2013年9月首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院疼痛門診符合入選與排除標(biāo)準(zhǔn)的痛風(fēng)患者10例，均為男性，年齡 24～59歲，平均 (41.3±9.9)歲;疼痛性質(zhì)為觸痛、酸痛或脹痛?；颊呔M(jìn)行非隨機(jī)、非盲開放研究，簽署書面知情同意書?；颊咧委熐暗囊话阗Y料見表1。

1.3 方法 入室后靜脈穿刺，連接輸血抗氧化管路，監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè)臭氧自體血治療流程:273 nm分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)量臭氧濃度1～100 mg/L，相當(dāng)于氧氣濃度0.1% ～5.0%;抗臭氧的負(fù)壓瓶?jī)?nèi)含有3.8%枸櫞酸鈉20 ml，吸入200 ml靜脈血，將所設(shè)定濃度的臭氧注入負(fù)壓瓶與靜脈血充分混合后，再回輸體內(nèi);3次/周，共10次。其中臭氧由醫(yī)用氧氣 (100%)通過(guò)德國(guó)赫爾曼公司生產(chǎn)的臭氧發(fā)生器產(chǎn)生;混合氣體中臭氧的濃度為20 mg/L。

分別采集患者治療前、第5次治療后和第10次治療后的靜脈血5 ml。血液靜止2 h后以3 000 r/min離心10 min(離心半徑為3 cm)，取血清備用，樣品在-80℃條件下儲(chǔ)存。采用免疫比濁法檢測(cè)血清IgA、IgM、IgG和補(bǔ)體C3、C4水平;采用流式細(xì)胞微球陣列分析方法 (CBA)檢測(cè)患者IL-8、IL-12和單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以 (±s)表示，采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 10例患者有9例完成全部治療，1例由于交通原因完成7次治療。在臭氧自體血治療后，1例患者的 HBeAb和 HBsAb、1例患者的類風(fēng)濕因子(RF)、1例患者的抗胰島素抗體 (ISN-Ab)均由陽(yáng)性變?yōu)殛幮浴?/p>

2.2 患者臭氧自體血治療前后免疫球蛋白及補(bǔ)體水平的變化 患者治療前、第5次治療后和第10次治療后IgA、IgM、IgG和補(bǔ)體C3、C4水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見表2)。

2.3 患者臭氧自體血治療前后炎性細(xì)胞因子水平的變化 患者治療前后IL-12、MCP-1水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);患者治療前后IL-8水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)?；颊叩?次治療后和第10次治療后IL-8水平均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表3)。

3 討論

痛風(fēng)是因嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄障礙致血尿酸水平升高的一組異質(zhì)性疾病，高尿酸血癥是痛風(fēng)的危險(xiǎn)因素［5-7］。目前，主要治療策略仍為控制急性發(fā)作、控制高尿酸血癥形成晶體，因此痛風(fēng)治療非常有限［8-11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臭氧自體血治療后炎性細(xì)胞因子IL-8水平下降，提示IL-8可能在痛風(fēng)的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

表1 痛風(fēng)患者治療前的一般資料Table 1 General information of gouty patients before treatment

表2 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白及補(bǔ)體水平比較 (±s，g/L)Table 2 Comparison of serum immunoglobulin cytokines and complement before and after ozonated autohemotherapy

表2 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后血清免疫球蛋白及補(bǔ)體水平比較 (±s，g/L)Table 2 Comparison of serum immunoglobulin cytokines and complement before and after ozonated autohemotherapy

時(shí)間 例數(shù) IgA IgM IgG C3 C 4.37 ±0.29第 5 次治療后 9 2.87 ±1.34 1.19 ±0.20 10.94 ±3.29 1.65 ±0.33 0.34 ±0.10第10 次治療后 9 2.76 ±1.27 1.21 ±0.11 10.87 ±3.06 1.51 ±0.18 0.32 ±0.09 F治療前 9 2.96 ±1.31 1.00 ±0.15 10.80 ±2.65 1.68 ±0.44 0 0.39 0.22 3.25 0.86 0.15 P值值0.76 0.82 0.15 0.49 0.86

表3 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后IL-8、IL-12及MCP-1水平比較(±s，ng/L)Table 3 Comparison of IL-8，IL-12 and MCP-1 before and after ozonated autohemotherapy

表3 痛風(fēng)患者臭氧自體血治療前后IL-8、IL-12及MCP-1水平比較(±s，ng/L)Table 3 Comparison of IL-8，IL-12 and MCP-1 before and after ozonated autohemotherapy

注:MCP-1=單核細(xì)胞趨化蛋白1;與治療前比較，*P＜0.05

時(shí)間 例數(shù)9 30.01 ±1.00 0.81 ±1.08 90.13 ±14.10第5 次治療后 9 15.36 ±0.62* 0.11 ±0.07 90.99 ±11.24第10 次治療后 9 10.36 ±0.61* 0.20 ±0.21 95.65 ±16.59 F IL-8 IL-12 MCP-1治療前14.73 1.40 1.22 P值值0.01 0.33 0.37

Kanevets等［12］發(fā)現(xiàn)，IgM抗體的F(ab')2片段與尿酸鈉 (MSU)晶體結(jié)合，IgM抗體在尿酸溶液中促進(jìn)MSU晶體沉積，這種沉積作用依賴于IgM的完整結(jié)構(gòu)。本研究結(jié)果顯示，治療前后IgM水平無(wú)差異，可能的機(jī)制是血清IgM抗體可以被特異性識(shí)別，在晶體表面起到穩(wěn)定初始晶體核的作用。臭氧自體血治療后，1例患者的HBeAb和 HBsAb、1例患者的 RF、1例患者的ISN-Ab均由陽(yáng)性變?yōu)殛幮?。可能的機(jī)制為痛風(fēng)患者自身免疫功能低下，臭氧激活免疫系統(tǒng)產(chǎn)生干擾素、IL、抗氧化酶，并可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生臍血細(xì)胞 (CTL)和自然殺傷細(xì)胞 (NK)，改善肝臟氧供，激活免疫系統(tǒng)的CD4+和CD8+細(xì)胞及自身免疫，從而抵御病毒，攻擊和殺死病毒。然而其確切機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

IL-8主要來(lái)源于單核細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，主要的生物學(xué)活性是吸引和激活中性粒細(xì)胞，中性粒細(xì)胞與IL-8接觸后發(fā)生形態(tài)變化，定向游走到反應(yīng)部位并釋放一系列活性產(chǎn)物;這些作用可導(dǎo)致機(jī)體局部的炎性反應(yīng)，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的目的［13］。IL-8參與單核細(xì)胞黏附力的粥樣硬化早期階段。IL-8獨(dú)特的功能特點(diǎn)是在急性炎癥部位t1/2相對(duì)較長(zhǎng)。在炎性反應(yīng)早期產(chǎn)生，但是數(shù)天和數(shù)周甚至更長(zhǎng)的時(shí)間仍有活性，這與其他許多炎性細(xì)胞因子在體內(nèi)幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生和清除不同［14］。IL-8對(duì)氧化物高度敏感，抗氧化物明顯減少IL-8的表達(dá)［15］。IL-8和其他化學(xué)因子調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的作用是臭氧自體血治療痛風(fēng)的基礎(chǔ)，也成為未來(lái)潛在治療痛風(fēng)的目標(biāo)。

在家兔急性痛風(fēng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕螹SU晶體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，注入MSU晶體到膝關(guān)節(jié)引起明顯腫脹，觀察滑膜和滑膜液中性粒細(xì)胞滲透情況，注射后12～24 h在滑膜襯里發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫反應(yīng)性的蛋白質(zhì)［16］。Dje N'Guessan等［17］證實(shí)，用他汀類藥物治療后氧化修飾低密度脂蛋白 (oxLDL)誘發(fā)IL-8和MCP-1分泌減少。本研究結(jié)果顯示，痛風(fēng)患者臭氧自體血治療后IL-8減少，有助于解釋該治療具有抗感染鎮(zhèn)痛的作用。

痛風(fēng)患者的炎性因子紊亂在發(fā)病機(jī)制中起重要作用。臭氧自體血治療臭氧濃度為20～55 mg/L，通過(guò)活性氧物質(zhì) (ROS)和脂質(zhì)過(guò)氧化物 (LOPs)激活免疫系統(tǒng)可能造成大量抗感染性因子〔IL-10、IL-12、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 (TGF-β)〕釋放。Bocci等［18］和Sagai等［19］報(bào)道，體外實(shí)驗(yàn)臭氧1 min內(nèi)能短暫性釋放IL-8，通過(guò)H2O2短暫的上升從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞液中，激活核因子 (NF)-κB抑制IL-8，清除ROS不能產(chǎn)生IL-8。本研究結(jié)果也支持臭氧促進(jìn)血清IL-8水平降低，IL-8水平升高可能加重患者痛風(fēng)疼痛的癥狀或者痛風(fēng)發(fā)作。與此相反，臭氧自體血治療期間患者均沒(méi)有痛風(fēng)急性發(fā)作，首先患者疼痛明顯減輕后IL-8水平下降?？赡苈酝达L(fēng)患者的急性發(fā)作或持續(xù)疼痛的炎癥機(jī)制與IL-8有關(guān)，IL-8是痛風(fēng)的重要遞質(zhì)，也可能是痛風(fēng)患者急性痛風(fēng)發(fā)作和轉(zhuǎn)歸的預(yù)測(cè)因素。

本研究從細(xì)胞水平探討了臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的可能機(jī)制，具有一定的創(chuàng)新性。存在的不足是患者對(duì)于治療后抽血檢查的依從性較差，導(dǎo)致研究患者例數(shù)較少;且本研究對(duì)象是痛風(fēng)患者，設(shè)立正常對(duì)照組不符合倫理要求。因此，本研究在獲得患者書面知情同意后，采用非隨機(jī)、非對(duì)照、非盲開放的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的細(xì)胞機(jī)制可能與抑制IL-8的釋放或作用有關(guān)，目前尚沒(méi)有臨床試驗(yàn)評(píng)估IL-8治療痛風(fēng)的有效性;痛風(fēng)患者的IgM與MSU結(jié)合是否促進(jìn)MSU晶體沉積尚未得出結(jié)果。解決以上問(wèn)題需進(jìn)行長(zhǎng)期、前瞻性和對(duì)照研究，且臭氧自體血治療痛風(fēng)緩解疼痛的確切機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

［1］ Hoffstein S，Weissmann G.Mechanisms of lysosomal enzyme release from leukocytes and interaction of monosodium urate crystals with dogfish and human leukocytes［J］.Arthritis Rheum，1975，18(2):153-165.

［2］ Quinn MT，Parthasarathy S，F(xiàn)ong LG，et al.Oxidatively modified low density lipoproteins:a potential role in recruitment and retention of monocyte/macrophages during atherogenesis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84(9):2995-2998.

［3］ Bocci V，Borrelli E，Travagli V，et al.The ozone paradox:ozone is a strong oxidant as well as a medical drug ［J］.Med Res Rev，2009，29(4):646-682.

［4］ Cao GQ，Li XH，Wu BS，et al.Safety and efficacy of ozonated autologous blood in treatment of patients with gout［J］.Chinese General Practice，2014，17(30):3609-3611.(in Chinese)

曹國(guó)慶，李秀華，武百山，等.臭氧化自體血治療痛風(fēng)患者疼痛的有效性和安全性研究 ［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2014，17(30):3609-3611.

［5］ Wallace KL，Riedel AA，Joseph-Ridge N，et al.Increasing prevalence of gout and hyperuri-cemia over 10 years among older adults in a managed care population ［J］.J Rheumatol，2004，31(8):1582-1587.

［6］ ChoiHK， Ford ES.Prevalenceofthemetabolicsyndromein individuals with hyperuricemia［J］.Am J Med，2007，120(5):442-447.

［7］ KramerHM， Curhan G.The association between goutand nephrolithiasis:the National Health and Nutrition Examination SurveyⅢ，1988-1994 ［J］.Am J Kidney Dis，2002，40(1):37-42.

［8］ Singh JA，Hodges JS，Toscano JP，et al.Quality of care for gout in the US needs improvement［J］.Arthritis Rheum，2007，57(5):822-829.

［9］ Fara N，Vazquez Mellado J，Sequeira G，et al.A survey on the current evaluation and treatment of gout in Buenos Aires，Argentina［J］.Reumatol Clin，2012，8(6):306-309.

［10］ Mikuls TR，Curtis JR，Allison JJ，et al.Medication errors with the use of allopurinol and colchicine:a retrospective study of a national，anonymous Internet-accessible error reporting system ［J］.J Rheumatol，2006，33(3):562-566.

［11］ Neogi T，Hunter DJ，Chaisson CE，et al.Frequency and predictors of inappropriate management of recurrent gout attacks in a longitudinal study ［J］.J Rheumatol，2006，33(1):104-109.

［12］ Kanevets U，Sharma K，Dresser K，et al.A role of IgM antibodies in monosodium urate crystal formation and associated adjuvanticity［J］.J Immunol，2009，182(4):1912-1918.

［13］ Gimbrone MA Jr， Obin MS， Brock AF， et al.Endothelial interleukin-8:a novel inhibitor of leukocyte-endothelial interactions［J］.Science，1989，246(4937):1601-1603.

［14］ DeForge LE，F(xiàn)antone JC，Kenney JS，et al.Oxygen radical scavengers selectively inhibit interleukin 8 production in human whole blood ［J］.J Clin Invest，1992，90(5):2123-2129.

［15］ DeForge LE，Preston AM，Takeuchi E，et al.Regulation of interleukin 8 gene expression by oxidant stress［J］.J Biol Chem，1993，268(34):25568-25576.

［16］ Nishimura A，Akahoshi T，Takahashi M，et al.Attenution of monosodium urate crystal-induced arthritis in rabbits by a neutralizing antibody against interleukin-8 ［J］.J Leuko Bio，1997，62(4):444-449.

［17］ Dje N'Guessan P，Riediger F，Vardarova K，et al.Statins control oxidized LDL-mediated histone modifications and gene expression in cultured human endothelial cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(3):380-386.

［18］ Bocci V，Valacchi G，Corradeschi F，et al.Studies on the biological effects of ozone:Effects on the total antioxidant status and on interleukin-8 production ［J］.Mediators Inflammation，1998，7(5):313-317.

［19］ Sagai M，Bocci V.Mechanisms of action involved in ozone therapy:is healing induced via a mild oxidative stress? ［J］.Med Gas Res，2011，20(1):29-31.