康文齡

NGAL在腎小管上皮細胞缺氧-復氧損傷中的作用及機制探討

康文齡

目的 探討中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白在大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）缺氧-復氧(H/R)損傷中的作用及機制。方法 體外培養(yǎng)NRK-52E，構(gòu)建細胞H/R模型，將細胞分為4組：正常對照組、H/R組、H/R +pcDAN3.1空載組、H/R+pcDAN3.1-NGAL組。結(jié)果 H/R組細胞相比正常對照組，凋亡率顯著增加（P＜0.05），細胞生長受受抑制（P＜0.05）。和H/R組進行對比，可發(fā)現(xiàn)H/R+pcDAN3.1-NGAL組細胞凋亡率明顯降低，G1期細胞所占的比例明顯下降，S期細胞所占的比例明顯增多，整體細胞量出現(xiàn)顯著的增殖現(xiàn)象，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 NGAL可通過促進腎小管上皮細胞增殖，抑制H/R誘導的細胞凋亡，在H/R損傷中發(fā)揮保護作用。

NGAL；缺血/再灌注損傷；腎小管上皮細胞；細胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白是kjeldsen L等1993年在中性粒細胞特異性顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種25Kd的小分子分泌型蛋白[1]。眾多研究表明，急性腎損傷發(fā)生時，腎小管上皮分泌的NGAL顯著增加，可作為AKI早期診斷及預后預測重要標志物[2]，但有關(guān)NGAL生物學功能尚不明確，本實驗通過建立大鼠腎小管上皮細胞缺氧-復氧(H/R)模型，探討NGAL在腎小管上皮細胞缺血/復氧損傷中的作用及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 HEPA—CLASS100三氣組織培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），大鼠腎小管上皮細胞(NRK-52E)（美國ATCC公司），pcDNA3.1空載及pcDAN3.1-NGAL質(zhì)粒由本實驗室制備；胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基（美國

Gibco公司），二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司），3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（北京索萊寶科技有限公司），細胞周期檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 從液氮罐中取出凍存的NRK-52E細胞，37℃的水浴迅速解凍后吸出細胞懸液，加入10倍體積采用含10%FBS的DMEM、100mg/mL鏈霉素和100mg/ mL青霉素的培養(yǎng)基混勻，1000r/min，離心5min，棄上清，重復洗滌1次后將細胞懸液稀釋混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞融合度達90%的細胞時，加入無血清培養(yǎng)基同步化12h，進行試驗[3-4]。將培養(yǎng)的NRK-52E細胞分4組：正常對照組；缺血/缺氧模型組（H/R組）；缺血/缺氧模型+pcDAN3.1空載組（H/R+pcDAN3.1空載組）；缺血/缺氧模型+pcDAN3.1-NGAL組（H/R+pcDAN3.1-NGAL組）。

1.3 pcDNA3.1-NGAL構(gòu)建及鑒定 提取出生1周內(nèi)的C57小鼠脾臟RNA，逆轉(zhuǎn)錄后得到NGAL cDNA，PCR擴增純化，并與載體pcDNA3.1/HisA用Acc65I 和EcoR1進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后在T4DNA連接酶作用下進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細菌中,在Amp平板上篩選培養(yǎng)，37℃過夜，次日挑取單個菌落的陽性克隆,在5mL含

AmpLB中培養(yǎng)，37℃搖床220rpm 振蕩培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，酶切鑒定。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NGAL對腎小管上皮細胞NRK-52E細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，H/R組NRK-52E細胞凋亡率顯著增加，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與H/R組相比，H/R+pcDNA3.1-NGAL組細胞凋亡率明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 MTT檢測細胞增殖 MTT法檢測細胞增殖結(jié)果表明，H/R刺激可抑制NRK-52E細胞生長，與正常對照組相比，H/R組細胞活化增殖明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，n=3），而與H/R組比較，H/R+pcDNA3.1-NGAL組細胞增殖率上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05,n=3）。見圖2。

2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞周期結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，H/R組及H/R+pcDAN3.1空載組細胞G1期比例增加，S期細胞比例降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，n=3），說明H/R刺激下NRK-52E細胞增殖受到抑制。與H/R組比較，H/ R+pcDNA3.1-NGAL組則表現(xiàn)為G1期細胞比例顯著降低，而S及G2期細胞比例增加（P＜0.05，n=3）。見圖3。

圖1 各組細胞凋亡率比較注：與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與HR組比較,#P＜0.05

圖2 各組細胞增殖能力變化注：與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與H/R組比較,#P＜0.05

圖3 各組細胞周期變化注：與正常對照組比較，**P＜0.01，*P＜0.05；與H/R組比較,#P＜0.05

3 討論

中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)作為一種小分子分泌型蛋白，在成人骨髓、子宮、前列腺、唾液腺、胃、闌尾、結(jié)腸和氣管以及胎兒脾臟和肺組織中都有低水平表達[5]，而在炎癥時的中性粒細胞、多種上皮癌細胞中表達顯著增高[6-7]。2006年Mishra J等觀察到缺血再灌注損傷后的小鼠腎臟和順鉑誘導的中毒性腎損害中，小鼠尿液中NGAL顯著增高[8]，引起人們對NGAL與腎臟損傷相關(guān)性的關(guān)注，多項研究報道顯示，NGAL作為抑制新的生物學標準，對AKI早期診斷及預后預測具有重大意義，有關(guān)NGAL的研究引起眾多學者們興趣。2011年Barasch研究小組在Nature Medcine[9]上報道AKI時尿中NGAL不是來自正常時也低表達NGAL的中性粒細胞、肝細胞、呼吸道和腸道等上皮細胞，而主要來自損傷腎上皮。

從本次實驗可知，與對照組相比較，H/R組中的NRK-52E細胞凋亡率明顯提高，G1期細胞所占的百分比也明顯增加，而S期細胞所占百分比卻明顯減小，這表明細胞增殖出現(xiàn)受阻的情況。與H/R組相比，H/R+pcDAN3.1-NGAL組細胞凋亡率明顯降低，G1期細胞所占的比例明顯下降，G2期細胞以及S期細胞所占的比例明顯增多，整體細胞量出現(xiàn)顯著的增值現(xiàn)象，這表明NGAL能夠有效抑制細胞凋亡，以此促進細胞的快速增殖，能夠起到保護腎小管內(nèi)的上皮細胞。

綜上所述，NGAL作為一種新發(fā)現(xiàn)的AKI早期診斷標志物，一方面可通過促進S期DNA合成促進細胞增殖，減輕缺血/復氧刺激導致的細胞生長抑制，另一方面，NGAL可下調(diào)多種促細胞凋亡分子表達，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典分子GRP78、CHOP、Caspase12，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導途徑，減少細胞凋亡。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.34.010

江西 338000 江西省新余市人民醫(yī)院 （康文齡）