方偉進(jìn)＊，馮梅＊，魯長(zhǎng)武，劉麗華，邱霓，熊燕，

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院和廣州蛇毒研究所，廣東廣州510182；2.中南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，湖南長(zhǎng)沙410078)

吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能不全的影響及其機(jī)制

方偉進(jìn)1＊，馮梅1＊，魯長(zhǎng)武2，劉麗華2，邱霓1，熊燕1，2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院和廣州蛇毒研究所，廣東廣州510182；2.中南大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，湖南長(zhǎng)沙410078)

目的探討吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC)對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能損害的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法雄性SD大鼠一次性ip給予鏈脲佐菌素60 mg·kg-1制備糖尿病模型，通過(guò)飲水中給予PDTC 10 mg·kg-1，連續(xù)治療8周。檢測(cè)血糖、血脂和血清內(nèi)源性一氧化氮合酶（NOS)抑制物非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸（ADMA)濃度。用含有人二甲基精氨酸二甲胺水解酶2（hDDAH2)基因的重組腺病毒（Ad5CMV-hDDAH2)體外感染糖尿病大鼠血管環(huán)，分別檢測(cè)感染前后血管環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)（Emax)、半數(shù)有效量（EC50)及血管組織DDAH活性。結(jié)果與正常組比較，糖尿病大鼠血糖明顯升高，血清ADMA濃度從正常組的（1.14±0.26)μmol·L-1升至（2.18±0.52)μmol·L-1（P＜0.01)；血管組織DDAH活性也從正常組的（0.10±0.02)U·g-1蛋白降至（0.05±0.01)U·g-1蛋白（P＜0.01)；血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能損傷，表現(xiàn)為Emax由正常組的（93.6±4.4)%降至（50.8±4.9)%（P＜0.01)，EC50由正常組的（88±22)nmol·L-1升至（240±45)nmol·L-1（P＜0.01)。PDTC治療降低血糖和血清ADMA濃度分別至（13.2±3.5)mmol·L-1和（1.40±0.25)μmol·L-1（P＜0.01)，增加血管DDAH活性至（0.08±0.02)U·g-1蛋白（P＜0.01)，改善內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能，使Emax增至（84.6±4.5)%，EC50降至（134±27)nmol·L-1（P＜0.01)。糖尿病大鼠血管轉(zhuǎn)染DDAH2基因后，血管DDAH活性及Emax和EC50的變化與PDTC治療組相似。結(jié)論P(yáng)DTC對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)血管DDAH活性，降低內(nèi)源性NOS抑制物ADMA蓄積有關(guān)。

糖尿??；內(nèi)皮，血管；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽；非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸；二甲基精氨酸二甲胺水解酶

糖尿病是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)疾病。糖尿病易并發(fā)心血管疾病，已成為糖尿病患者致殘、致死的主要原因。然而，其發(fā)病機(jī)制卻不完全清楚，更缺乏有效的防治藥物。內(nèi)皮功能不全是糖尿病血管病變的早期標(biāo)志，并在糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。其主要特征為乙酰膽堿誘導(dǎo)的、一氧化氮（nitric oxide，NO)介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張反應(yīng)降低或消失［1］。NO是內(nèi)皮細(xì)胞合成、分泌的一種強(qiáng)大舒血管因子，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS)催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化而來(lái)；體內(nèi)存在一種調(diào)節(jié)NO合成的內(nèi)源性機(jī)制，L-精氨酸的同系物非對(duì)稱(chēng)性二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA)是NOS的內(nèi)源性抑制物，能夠與L-精氨酸競(jìng)爭(zhēng)NOS，從而減少NO生成。因此，ADMA是體內(nèi)NO合成的抑制性調(diào)節(jié)物［2］。內(nèi)源性ADMA是在體內(nèi)蛋白質(zhì)新陳代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生的，除了少部分經(jīng)腎原形排出以外，90%以上的ADMA是由廣泛存在于組織細(xì)胞中的二甲基精氨酸二甲胺水解酶（dimethylarginine

dimethylamino hydrolase，DDAH)代謝為L(zhǎng)-胍氨酸和二甲胺。因此，DDAH活性是決定體內(nèi)ADMA濃度的關(guān)鍵因素［3］。

早在1997年，我們率先研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血中內(nèi)源性ADMA濃度升高，并與其胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能降低密切相關(guān)［4］；隨后的研究進(jìn)一步顯示，內(nèi)源性ADMA升高不僅與糖尿病大血管并發(fā)癥密切相關(guān)，還與糖尿病的代謝控制有關(guān)[5]。Lin等[6]認(rèn)為，糖尿病大鼠內(nèi)源性ADMA升高是由于血管組織DDAH活性降低所致，而與其表達(dá)改變無(wú)關(guān)；用高糖孵育培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞或用糖基化蛋白孵育正常大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)均可抑制其DDAH活性，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能不全［6-7］。因此，尋找上調(diào)DDAH活性或表達(dá)的藥物或措施對(duì)改善血管內(nèi)皮功能不全、防治糖尿病心血管并發(fā)癥具有重要意義。

吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)為NF-κB的抑制劑，可通透細(xì)胞膜抑制多種細(xì)胞中NF-κB的激活；PDTC也是一種含巰基化合物，具有很強(qiáng)的捕捉非配對(duì)電子或直接清除氧自由基以及增加還原型谷胱甘肽等抗氧化作用。因此，大量文獻(xiàn)報(bào)道，PDTC既可阻止腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子［8］；也可抑制炎性因子的表達(dá)和活性氧（reactive oxygen species，ROS)的生成［9］。還有研究表明，PDTC可保護(hù)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)抗TNF-α和氧化型低密度脂蛋白對(duì)DDAH活性的抑制［10］。但PDTC能否保護(hù)糖尿病大鼠血管DDAH活性，改善糖尿病血管內(nèi)皮功能不全尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。本研究擬在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，觀察PDTC治療8周對(duì)其內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能損傷以及血管組織DDAH活性的影響，并與體外轉(zhuǎn)染DDAH比較；為揭示PDTC對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮功能的保護(hù)作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，亦為糖尿病內(nèi)皮功能不全或心血管疾病的臨床防治及其新藥研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

苯腎上腺素、乙酰膽堿、PDTC、葡萄糖、安替比林、二乙酰單肟、STZ和ADMA均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM培基購(gòu)自Gibco BRL（Gaithersburg，美國(guó))，小牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；重組編碼人類(lèi)DDAH2基因的腺病毒Ad5CMV-hDDAH2由本室構(gòu)建［11］；重組編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal)基因的腺病毒Ad5CMVβ-Gal由中南大學(xué)湘雅第二附屬醫(yī)院鄭煜煌教授惠贈(zèng)；血糖及血脂測(cè)定試劑盒〔包括總膽固醇（total cholesterol，TC)、甘油三酯（triglyceride，TG)、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL)和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL)〕為浙江東甌生物工程有限公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 糖尿病大鼠模型的制備與分組

體質(zhì)量為（220±10）g的清潔級(jí)健康雄性SD大鼠25只，由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（湘）2009-0004。所有的大鼠均在自由飲水和進(jìn)食的條件下分籠飼養(yǎng)，室溫維持在（20～24)℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對(duì)照組、PDTC對(duì)照組、糖尿病模型組和PDTC治療組，每組5～7只。禁食12 h后，除正常對(duì)照組和PDTC組外，大鼠一次性ip給予STZ 60 mg·kg-1（pH為4.2的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液0.1 mol·L-1冰浴中新鮮配制)，72 h后用尿糖試紙測(cè)定尿糖，凡尿糖為+++～++++的大鼠再檢測(cè)血糖，凡連續(xù)2次隔日測(cè)得隨機(jī)血糖≥16 mmol·L-1者認(rèn)為糖尿病模型成立，血糖不符合要求的大鼠則被剔除。PDTC治療組飲水中給予PDTC（10 mg·kg-1)，連續(xù)8周。PDTC劑量的選擇是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道長(zhǎng)期給藥具有抗氧化或抑制NF-κB作用的最小劑量［12-13］。為了確保飲水給藥的劑量準(zhǔn)確，每天稱(chēng)取每只大鼠的給藥量溶解在100 mL的飲水中，待大鼠全部喝完再換清水飲用。

1.3 血樣及離體血管標(biāo)本采集

飼養(yǎng)8周后，大鼠在戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1，ip)麻醉下行頸動(dòng)脈插管收集血標(biāo)本（含或不含抗凝劑)并于4℃下離心15 min（3000×g)，分離血漿或血清用于生化指標(biāo)的測(cè)定。在取血后立即打開(kāi)大鼠胸腔，摘取胸主動(dòng)脈置于冷（4℃)Krebs-Henseleit（K-H)緩沖液（mmol·L-1：NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，葡萄糖11.0)中，并持續(xù)充以95%O2和5% CO2的混合氣體；小心剔除血管周?chē)Y(jié)締組織及脂肪組織，避免損傷血管內(nèi)皮；將胸主動(dòng)脈剪成3～4 mm的血管環(huán)，用于血管舒張功能的檢測(cè)和體外基因轉(zhuǎn)染；其余的血管用于DDAH活性測(cè)定。

1.4 血糖、血脂和血清ADMA含量測(cè)定

血漿葡萄糖含量采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定并在取血后1 h內(nèi)完成：取10 μL血漿，加1.5 mL酶工作液，混勻后置37℃水浴10 min，在500 nm波長(zhǎng)下比色讀取各管吸光度值，并計(jì)算各管葡萄糖含量。

各組大鼠血脂含量包括TC，TG，HDL和LDL的測(cè)定均參照試劑盒的方法進(jìn)行，采用固醇氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法檢測(cè)TC，采用甘油磷酸氧化酶-過(guò)氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法檢測(cè)TG，采用磷鎢酸鎂沉淀法和聚乙烯硫酸沉淀法檢測(cè)HDL和LDL。

采用高效液相色譜法檢測(cè)血清ADMA濃度［14］，取血清1 mL，加入5-磺基水楊酸沉淀蛋白，離心后取10 μL血清樣本或標(biāo)準(zhǔn)品加入100 μL衍生試劑（鄰苯二甲醛與硼酸緩沖液及β-巰基乙醇的混合物)，混勻，室溫下反應(yīng)3 min后進(jìn)樣，然后用線性梯度洗脫的方式將樣品從分析柱中洗脫。流動(dòng)相為4%乙腈和0.4%三氟乙酸；流速為0.2 mL·min-1。經(jīng)過(guò)柱處理后，用MS-2010質(zhì)譜儀對(duì)樣品及內(nèi)標(biāo)ADMA進(jìn)行測(cè)定（m/z：ADMA=203，氮?dú)饬魉贋?.0 L·min-1)。

1.5 糖尿病大鼠血管轉(zhuǎn)染Ad5CM-hDDAH2

按本室已建立的方法［15］體外轉(zhuǎn)染DDAH基因至糖尿病血管，采用攜帶hDDAH2基因的重組腺病毒Ad5CMV-hDDAH2和對(duì)照腺病毒攜帶β-gal基因的重組腺病毒Ad5CMVβ-Gal（1.5×1010L-1)懸液在37℃下分別孵育糖尿病大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)

2 h，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組用等容積的PBS在37℃下孵育2 h；然后用PBS清洗再換成含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基在恒溫37°C的器官浴槽中繼續(xù)孵育24 h，并持續(xù)充以95%O2+5%CO2；孵育結(jié)束后，測(cè)定血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能和DDAH活性。

1.6 血管環(huán)內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的檢測(cè)

按照我室已建立的大鼠離體血管環(huán)內(nèi)皮依賴(lài)性舒張的檢測(cè)方法［16］，將1.2中的各組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)和1.5中轉(zhuǎn)染腺病毒的糖尿病模型組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，固定于盛有5 mL K-H緩沖液的器官浴槽中，并連接張力換能器；用MS-302生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)描記張力變化；浴槽恒溫37℃并持續(xù)充以95% O2和5%CO2的混合氣，每隔15 min更換浴槽中K-H液；實(shí)驗(yàn)時(shí)血管環(huán)加靜息張力2 g，平衡90 min；先用60 mmol·L-1的KCl使血管環(huán)平滑肌去極化，重復(fù)此過(guò)程至血管環(huán)收縮達(dá)坪值；沖洗后平衡血管環(huán)30 min，用苯腎上腺素1 μmol·L-1預(yù)收縮血管，待張力上升并穩(wěn)定后，加入0.03～3 μmol·L-1累積濃度的乙酰膽堿舒張血管，檢測(cè)血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能；并計(jì)算各組血管環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)（Emax)和半數(shù)有效量（EC50)；同時(shí)比較PDTC治療和體外轉(zhuǎn)染DDAH2基因的糖尿病血管環(huán)內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能。

1.7 血管DDAH活性的測(cè)定

按照本室已建立的DDAH活性測(cè)定方法［17］，檢測(cè)各組血管環(huán)DDAH活性。將大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)分別置于試管中剪碎，加入冰磷酸緩沖液（0.1 mol·L-1，pH 6.5)制成5%組織勻漿，4℃下3500×g離心30 min，取50 μL上清與ADMA 1 mmol·L-1反應(yīng)，并與二乙酰單肟和安替比林共孵育100 min；采用UV755B分光光度計(jì)讀取466 nm處吸光度值（A466nm)；每個(gè)樣品分別檢測(cè)2管，其中一管加底物ADMA作測(cè)定管，另一管不加底物ADMA作為自身陰性對(duì)照管，并從每個(gè)樣品測(cè)定管的數(shù)值中減去自身陰性對(duì)照管的數(shù)值，以得出DDAH活性的實(shí)際數(shù)值；根據(jù)L-胍氨酸濃度（μmol·L-1)=標(biāo)準(zhǔn)管胍氨酸濃度×（測(cè)定管A值－陰性對(duì)照管A值)/標(biāo)準(zhǔn)管A值。計(jì)算L-胍氨酸的生成量以反映DDAH活性；DDAH的酶活性單位定義為37℃下每分鐘催化形成1 μmol·L-1L-胍氨酸所需DDAH量，并用組織勻漿中的蛋白含量（采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒方法測(cè)定)標(biāo)化，以U·g-1蛋白表示。

1.8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間差異比較用方差分析和Newman-Keuls檢驗(yàn)，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDTC對(duì)糖尿病大鼠血糖和血脂水平的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，糖尿病大鼠的血糖水平顯著升高（P＜0.01)，PDTC 10 mg·kg-1治療8周后明顯降低糖尿病大鼠的血糖值（P＜0.01)。此外，糖尿病大鼠還出現(xiàn)明顯的血脂代謝異常，表現(xiàn)為血清TC，TG和LDL水平均明顯升高（P＜0.01)，而HDL含量則降低（P＜0.05)，PDTC治療糖尿病大鼠8周后，雖有降低TC，TG和LDL和升高HDL的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PDTC本身對(duì)正常大鼠的血糖和血脂水平并無(wú)明顯影響。

Tab.1 Effect of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC)on palsma glucose,total cholesterol（TC)，triglycerides（TG)，low density lipoprotein（LDL)and high density lipoprotein（HDL)in diabetic rats

2.2 PDTC對(duì)糖尿病大鼠血清ADMA含量的影響

糖尿病大鼠血清中ADMA含量較正常對(duì)照組大鼠顯著升高〔2.18±0.52 vs（1.14±0.26)μmol·L-1，n=5，P＜0.01〕；給予PDTC 10 mg·kg-18周后，血清ADMA含量明顯降低（1.40±0.25 vs 2.18± 0.52 μmol·L-1，n=5，P＜0.05)。PDTC組對(duì)正常大鼠血清ADMA含量無(wú)明顯影響〔1.12±0.22 vs（1.14±0.27)mol·L-1，n=5〕。

2.3 PDTC對(duì)糖尿病大鼠血管DDAH活性的影響

糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈中DDAH活性明顯低于正常對(duì)照組〔（0.05±0.01)vs（0.10±0.02)U·g-1蛋白，n=5，P＜0.01〕；PDTC治療8周可改善血管DDAH活性，使其恢復(fù)接近正常水平〔（0.08±0.02) vs（0.05±0.01)U·g-1蛋白，n=5，P＜0.01〕。PDTC對(duì)正常大鼠主動(dòng)脈DDAH活性無(wú)影響〔（0.10±0.02) vs（0.10±0.02)U·g-1蛋白，n=5〕。

2.4 PDTC對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的影響

如圖1和表2所示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)明顯降低，表現(xiàn)為最大舒張反應(yīng)降低〔（50.8±4.9)%vs（93.6±4.4)%，P＜0.01〕，EC50升高（240±45 vs 88±22 nmol·L-1，P＜0.01)，提示血管內(nèi)皮功能受損。給予PDTC 8周后，糖尿病大鼠血管的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能明顯改善，使乙酰膽堿誘導(dǎo)的Emax升高〔（84.6±4.5)%vs（50.8±4.9)%，P＜0.01〕，EC50降低（134±27 vs 240±45 nmol·L-1，P＜0.01)，PDTC對(duì)照組大鼠內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)與正常對(duì)照組卻無(wú)明顯差異〔（96.7±4.7)%vs（93.6±4.4)%〕。

Fig.1 Effect of PDTC on endothelium-dependent relaxation of thoracic aortas in diabetic rats.See Tab.1 for the treatment.compared with normal control group;#P＜0.05,##P＜0.01，compared with DM group.

Tab.2 Emaxand EC50values for acetylcholine-induced relaxation of isolated aortic rings

2.5 體外轉(zhuǎn)染Ad5CMV-hDDAH2對(duì)血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的影響

Fig.2 Effect of ex vivo DDAH2 gene transfer on endothelium-dependent relaxation of aortic rings of normal and diabetic rats.Isolated thoracic aortic rings from normal and diabetic rats were incubated with the recombinant adenovirus encoding human DDAH2 gene（Ad5CMV-hDDAH2 transfection),recombinant adenovirus encoding β-galactosidase gene（Ad5CMVβ-Gal transfection)and PBS（untransfection)at 37℃for 2 h,respectively.After 24 h of gene transfection,the endothelium-dependent relaxation response to acetylcholine was measured in these aortic rings.x±s,n=5.＊P＜0.05,compared with untransfected aortas from normal rats;#P＜0.05,compared with Ad5CMVβ-Gal transfected aortas from normal rats;△△P＜0.01,compared with untransfected aortas from diabetic rats;▲▲P＜0.01,compared with Ad5CMVβ-Gal transfected aortas from diabetic rats.

如圖2和表3所示，用1.5×1013L-1的Ad5CMV-hDDAH2孵育糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)2 h后，再換用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育血管環(huán)24 h，可改善糖尿病大鼠內(nèi)皮依賴(lài)性血管舒張功能的抑制，使Emax顯著升高〔（85.1±3.8)%vs（54.6±2.7)%，P＜0.01〕而EC50降低〔119±15vs（249±24)nmol·L-1，P＜0.01〕；而用相同滴度的重組Ad5CMVβ-Gal腺病毒孵育糖尿病組大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，卻不能改變其內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的損害〔（54.4±4.0)%vs（54.6± 2.7)%〕；用相同滴度的Ad5CMV-hDDAH2孵育正常對(duì)照組動(dòng)物的胸主動(dòng)脈環(huán)，雖不影響Emax值，但增加血管對(duì)乙酰膽堿反應(yīng)的敏感性，使EC50明顯降低〔77±18vs（133±45)nmol·L-1，P＜0.05〕。以上結(jié)果表明，重組hDDAH2腺病毒體外轉(zhuǎn)染能逆轉(zhuǎn)糖尿病大鼠血管的內(nèi)皮功能不全，并且過(guò)表達(dá)DDAH2改善糖尿病大鼠血管內(nèi)皮功能不全的作用與PDTC的治療作用相當(dāng)。

Tab.3 Effect of ex vivo DDAH2 gene transfer on Emaxand EC50values for acetylcholine-induced relaxation of isolated rat aortic rings

2.6 體外轉(zhuǎn)染Ad5CMV-hDDAH2對(duì)血管環(huán)DDAH活性的影響

圖3結(jié)果顯示，用重組hDDAH2腺病毒（1.5× 1013L-1)孵育血管環(huán)2 h，再換用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h后既可增加正常對(duì)照組血管組織DDAH活性〔0.21±0.05vs（0.10±0.02)U·g-1蛋白，P＜0.01〕，而且也可阻止糖尿病大鼠血管組織DDAH活性的降低〔0.22±0.04vs（0.06±0.01)U·g-1蛋白，P＜0.01〕；然而轉(zhuǎn)染β-Gal基因?qū)φ４笫蠛吞悄虿〈笫笱芙M織DDAH活性均無(wú)明顯影響。通過(guò)計(jì)算正常對(duì)照組血管和糖尿病血管在轉(zhuǎn)基因前后血管組織DDAH活性的比值，即可看出，此重組腺病毒在正常大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的轉(zhuǎn)染效率為2倍以上，而在糖尿病大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)的轉(zhuǎn)染效率則為3～4倍。

Fig.3 Effect of ex vivo DDAH2 gene transfer on DDAH activities in aortas of diabetic rats.See Fig.2 for the treatment.compared with normal control group；##P＜0.01,compared with corresponding untransfection group；△△P＜0.01,compared with corresponding β-Gal transfection group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，給予PDTC治療STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠8周，雖然不能顯著改善糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝異常，但可明顯降低糖尿病大鼠的血糖水平；該結(jié)果與Stosic-Grujicic等［18］的研究報(bào)道一致。這可能與PDTC保護(hù)糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞功能有關(guān)。最近有研究發(fā)現(xiàn)，給予糖尿病大鼠PDTC治療不僅可明顯降低血糖，還可顯著增加胰島細(xì)胞中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，降低氧化應(yīng)激及β細(xì)胞凋亡，并可通過(guò)降低叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族1的乙?；却龠M(jìn)β細(xì)胞分泌胰島素［19］。

本研究還揭示，PDTC明顯改善糖尿病大鼠血管的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能，使乙酰膽堿誘導(dǎo)的最大舒張反應(yīng)升高、而半數(shù)有效濃度降低；提示PDTC對(duì)糖尿病內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能損害具有保護(hù)作用；并且PDTC的這種保護(hù)作用，是通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞中可供利用的NO以改善血管內(nèi)皮功能所致。雖然有研究報(bào)道，PDTC治療可抑制高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和單核細(xì)胞的黏附［20］；也可減少2型糖尿病小鼠（db/db小鼠)心肌活性氧的產(chǎn)生并改善線粒體功能［21］；還可降低2型糖尿病大鼠（OLETF大鼠)腸系膜內(nèi)皮衍生收縮因子的合成與釋放［22］；但尚未見(jiàn)PDTC治療保護(hù)糖尿病血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。

然而，有關(guān)PDTC增加內(nèi)皮細(xì)胞中可供利用的NO、改善糖尿病血管內(nèi)皮功能的確切機(jī)制不清楚。大量研究表明，內(nèi)源性NOS抑制物ADMA升高是導(dǎo)致糖尿病內(nèi)皮功能不全的關(guān)鍵因素［4-7，11，17］。Lin等［6］進(jìn)一步研究證明，糖尿病大鼠內(nèi)源性ADMA升高是由于血管組織DDAH活性降低所致。因此，本研究觀察了PDTC對(duì)糖尿病大鼠血清內(nèi)源性ADMA濃度和血管組織DDAH活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDTC治療8周，不僅降低糖尿病大鼠血清內(nèi)源性NOS抑制物ADMA水平，還增加血管組織DDAH活性。雖然有研究報(bào)道，PDTC可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞抵抗TNF-α和氧化型低密度脂蛋白對(duì)DDAH活性的抑制［10］，但PDTC保護(hù)糖尿病大鼠血管DDAH活性，降低內(nèi)源性ADMA水平尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道；該結(jié)果提示，保護(hù)糖尿病血管DDAH活性可能是PDTC降低內(nèi)源性NOS抑制物ADMA蓄積、改善血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能的重要機(jī)制。至于PDTC保護(hù)糖尿病血管DDAH活性的進(jìn)一步機(jī)制尚不得而知，推測(cè)可能與其抗氧化作用有關(guān)。因?yàn)橐环矫嬗醒芯繄?bào)道DDAH活性及表達(dá)均可被氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)［23］，另一方面具有抗氧化作用的卡托普利也能保護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化血管DDAH活性，降低內(nèi)源性ADMA含量［24］。但PDTC保護(hù)糖尿病血管DDAH活性是否與其抑制NF-κB活化有關(guān)也尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

為探討PDTC改善糖尿病血管內(nèi)皮功能不全是由于保護(hù)血管DDAH活性所致，本研究還采用含有hDDAH2基因的腺病毒體外感染糖尿病大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)使其過(guò)表達(dá)DDAH，觀測(cè)血管環(huán)DDAH活性及內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能改變并與PDTC治療作用類(lèi)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDTC的治療作用與體外轉(zhuǎn)染DDAH2的效果相當(dāng)。此外，作者實(shí)驗(yàn)室以前的研究也發(fā)現(xiàn)，體外轉(zhuǎn)染DDAH2至動(dòng)脈粥樣硬化兔血管亦可改善其內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能障礙［13］。這些結(jié)果提示，增加血管壁DDAH活性對(duì)維持血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能至關(guān)重要。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，PDTC治療8周可改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠血管內(nèi)皮依賴(lài)性舒張功能損害，其機(jī)制可能與保護(hù)血管DDAH活性，降低內(nèi)源性NOS抑制物ADMA蓄積有關(guān)。本研究為糖尿病內(nèi)皮功能不全的臨床防治及其藥物研發(fā)提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和啟示。

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Effect and mechanism of pyrrolidine dithiocarbamate on vascular endothelial dysfunction in diabetic rats

FANG Wei-jin1＊,FENG Mei1＊,LU Chang-wu2,LIU Li-hua2,QIU Ni1,XIONG Yan1,2
（1.Guangzhou Institute of Snake Venom Research,School of Pharmaceutical Sciences,Guangzhou Medical University,Guangzhou 510182,China;2.Department of Pharmacology,School of Pharmaceutical Sciences,Central South University,Changsha 410078,China)

OBJECTlVETo investigate the protective effects and mechanisms of pyrrolidine dithiocarbamate（PDTC)against the impairment of endothelium-dependent vasodilation function in diabetic rats.METHODSA diabetic model was induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin（STZ,60 mg·kg-1)to male SD rats.Some of the diabetic rats were treated with PDTC（10 mg·kg-1·d-1) added to drinking water for 8 weeks after diabetes was induced.The levels of blood glucose,serum lipid profiles and endogenous nitric oxide synthase（NOS)inhibitor asymmetric dimethylargininedimethylarginine dimethylaminohydrolase 2（DDAH2)gene adenovirus（Ad5CMV-hDDAH2)wasex vivotransfected to diabetic aortic rings.RESULTSThe diabetic rats displayed a significant increase in blood glucose levels compared to normal control group.Serum ADMA levels were elevated from（1.14±0.26)μmol·L-1to（2.18±0.52)μmol·L-1（P＜0.01)，while vascular DDAH activity was decreased from（0.10±0.02)U·g-1protein to（0.05±0.01)U·g-1protein（P＜0.01)in diabetic rats compared with normal control group,respectively.The endothelium-dependent relaxation response to acetylcholine was significantly impaired,as expressed by the decreasedEmaxfrom（93.6±4.4)%to（50.8±4.9)% and increased EC50from（88±22)nmol·L-1to（240±45)nmol·L-1（P＜0.01)in diabetic rats compared to control group.Treatment with PDTC not only decreased the blood glucose level〔（13.2±3.5)mmol·L-1〕and serum ADMA concentration（1.40±0.25 μmol·L-1,P＜0.01)but also increased vascular DDAH activity〔（0.08±0.02)U·g-1protein,P＜0.01〕and endothelium-dependent relaxation,as expressed by a higherEmax（84.6±4.5)%（P＜0.01)and lower EC50（134±27)nmol·L-1（P＜0.01)in diabetic rats.Similar results ofEmax,EC50and DDAH activity could also be observed whenhDDAH2gene wasex vivotransferred to isolated aortic rings from diabetic rats.CONCLUSlONThese results indicate that PDTC can protect against the impairment of endothelial function in diabetic rats,the mechanisms underlying which may involve the upregulation of DDAH activity and the decrease in endogenous ADMA accumulation in vascular endothelium.

diabetes；endothelium，vascular；pyrrolidine dithiocarbamate；asymmetric dimethylarginine；dimethylarginine dimethylaminohydrolase

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81170778);and National Natural Science Foundation of China（30873062)

XIONG Yan,E-mail:Xiongyan2001＠yahoo.com

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.002

2015-01-26接受日期：2015-06-04)（本文編輯：?jiǎn)毯?

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81170778)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30873062)

方偉進(jìn)（1987-)，男，博士研究生；熊燕（1960-)，女，教授，博士生導(dǎo)師,主要從事藥理學(xué)研究。

熊燕，E-mail:xiongyan2001@yahoo.com

＊共同第一作者

＊Co-first authors.