趙興秀，何義國(guó)，趙長(zhǎng)青，方春玉，張靜，鄒偉（四川理工學(xué)院，四川自貢643000）

脂肪酶固定化及其催化生物柴油研究

趙興秀，何義國(guó)，趙長(zhǎng)青，方春玉，張靜，鄒偉
（四川理工學(xué)院，四川自貢643000）

摘要：得到脂肪酶固定化的最佳條件及固定脂肪酶對(duì)生物柴油的轉(zhuǎn)化率。利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定脂肪酶固定化的最佳條件，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析合成生物柴油的主要成分。結(jié)果：脂肪酶固定化的最佳條件：緩沖液pH 7.5、載體/酶液比為25mg/mL、固定化溫度應(yīng)為40℃，其固定化酶活力為68.25U/g，利用固定脂肪酶催化合成生物柴油的轉(zhuǎn)化率高達(dá)75%。結(jié)果表明：固定化酶比游離酶具有更高的催化效率，對(duì)高溫和pH具有更高的耐受性。固定化脂肪酶催化效率高、操作穩(wěn)定性較強(qiáng)，具有較好的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

關(guān)鍵詞：脂肪酶；固定化；大孔樹脂；生物柴油

脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、皮革、洗滌劑、醫(yī)藥、印染、能源等領(lǐng)域[1]。利用脂肪酶催化合成生物柴油是制備新能源的一條新途徑[2-3]，由于生物柴油可再生，對(duì)環(huán)境友好，且石化資源逐漸減少，研制生物柴油極具經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[4]。目前美國(guó)、巴西、日本及歐洲發(fā)達(dá)國(guó)家，已經(jīng)開始利用脂肪酶大規(guī)模催化合成生物柴油[5-7]。我國(guó)這在方面起步晚，但國(guó)家對(duì)新能源戰(zhàn)略非常重視，尤其關(guān)注生物柴油的研究進(jìn)展，已有不少文獻(xiàn)對(duì)脂肪酶合成生物柴油進(jìn)行了報(bào)道[8-10]，其中脂肪酶的催化條件是合成生物柴油的關(guān)鍵，雖然游離酶和固定化酶均可發(fā)揮作用，但作用環(huán)境和作用效果如何，卻鮮有文獻(xiàn)將二者的催化效果同時(shí)研究。

本論文系統(tǒng)研究了從脂肪酶的制備到生物柴油合成的全過(guò)程，包括酶的固定化條件和固定化酶的穩(wěn)定性，比較了游離酶和固定化酶的催化效果，將合成的生物柴油進(jìn)行氣相-質(zhì)譜分析，以期對(duì)工業(yè)上固定化酶催化合成生物柴油提供參考數(shù)據(jù)和理論參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存產(chǎn)脂肪酶菌株，編號(hào)分別為1、2、3、4。

1.1.2儀器與試劑

生化培養(yǎng)箱（LHP-250）：上海經(jīng)藝儀器設(shè)備有限公司；酶標(biāo)儀ELx808美國(guó)伯騰儀器有限公司；氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS 6800）：江蘇天瑞儀器股份有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2培養(yǎng)基的配制

斜面培養(yǎng)基（%）：蛋白胨0.5 g，葡萄糖0.5 g，酵母膏0.3 g，NaCl0.5 g，Na2HPO40.1 g，瓊脂20 g。

種子培養(yǎng)基（%）：蛋白胨0.5 g，蔗糖0.5 g，NaCl 0.3 g，K2HPO40.2 g，酵母浸膏0.5 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：蛋白胨2 g，蔗糖0.5 g，橄欖油0.5g，（NH4）2SO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.1g，K2HPO40.1g。1.3脂肪酶活力測(cè)定（NaOH滴定法[11]）

游離酶活力的測(cè)定：在40℃、pH 7.5條件下游離酶液水解脂肪（油脂），每分鐘水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為1個(gè)脂肪酶活單位（U/mL）。

固定化酶活力的測(cè)定：在40℃、pH 7.5條件下固定化酶水解脂肪（油脂），每分鐘水解產(chǎn)生1μmol脂肪酸的脂肪酶量定義為1個(gè)脂肪酶活單位（U/mL）。

1.4蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.5出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶

將斜面培養(yǎng)基中的出發(fā)菌株接種于種子液，于37℃、160 r/min搖床培養(yǎng)16 h，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，同等條件培養(yǎng)36 h，將發(fā)酵液于8 000 r/min離心15 min，獲得上清液即為酶液。

1.6脂肪酶固定化

1.6.1大孔樹脂預(yù)處理

用95%的乙醇浸泡D101型大孔樹脂24 h，真空抽濾后，用蒸餾水沖洗。再依次用5%鹽酸的和5%氫氧化鈉溶液浸泡4 h，抽濾，用蒸餾水洗至中性。抽濾后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2大孔樹脂固定脂肪酶

將經(jīng)預(yù)處理的D101型大孔樹脂、緩沖液和脂肪酶置于水浴鍋中恒溫震蕩吸附4 h后，真空抽濾，用緩沖液洗滌固定化酶3次～5次，抽干后于4℃保存。

1.7固定化脂肪酶單因素實(shí)驗(yàn)

分別用不同的pH緩沖液、固定化溫度和載體/酶液比，測(cè)定磁力攪拌吸附4 h脂肪酶蛋白固定率和固定化酶活力。

1.8固定化脂肪酶正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以緩沖液pH、固定化溫度和載體/酶液比3因素為考察對(duì)象，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，確定脂肪酶固定的最佳條件。

1.9固定化脂肪酶的水解性質(zhì)研究

分別在不同溫度和不同pH條件下測(cè)定固定化酶和游離酶的水解活力。

1.10固定化脂肪酶催化合成生物柴油

將大豆油、甲醇、正己烷和固定脂肪酶按質(zhì)量比為5∶5∶15∶1的比例依次加入反應(yīng)器中，于45℃、160 r/min反應(yīng)4 h，反應(yīng)過(guò)程中甲醇分3次加入。反應(yīng)結(jié)束后濾出固定化脂肪酶，并離心除去粗甘油，水浴蒸餾除去有機(jī)溶劑，用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)合成生物柴油的成分及含量。濾出的固定化脂肪酶用正己烷洗滌3次后作為下一輪反應(yīng)的催化劑，重復(fù)試驗(yàn)8批次，計(jì)算每批次生物柴油轉(zhuǎn)化率，確定固定化脂肪酶的催化效率和操作穩(wěn)定性。

1.11氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)分析生物柴油

將合成的生物柴油用Agilent TSQ8000氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)）檢測(cè)分析，其色譜條件：初始溫度60℃，保留時(shí)間1.0min，15℃/min升溫至280℃，保留時(shí)間7min，進(jìn)樣器溫度300℃，檢測(cè)器溫度280℃，載氣N2，柱前壓8.16 kPa，流量1.8mL/min，分流比為1∶25。質(zhì)譜條件：離子源EI，離子源溫度230℃，離子化能量70 eV，輔助線溫度280℃，掃描范圍20 amu～500 amu，掃描時(shí)間0.35 s，回掃時(shí)間0.05 s。

2　結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)脂肪酶菌株的復(fù)篩

將保存的4株產(chǎn)脂肪酶菌進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng)離心后得上清液，以NaOH滴定法分別測(cè)定其酶活，結(jié)果如圖1。

圖1　菌株酶活力測(cè)定Fig.1　Theenzym eactivity of the stains

由圖1可知，4菌株所產(chǎn)脂肪酶均具有較高的酶活，酶活最小的是3號(hào)菌，為32.25U/mL，1號(hào)菌的酶活最大，為54.38U/mL，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將1號(hào)菌作為本試驗(yàn)的產(chǎn)酶菌株。

2.2蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以牛血清蛋白含量為橫坐標(biāo)，其OD595為縱坐標(biāo)，得到蛋白質(zhì)量與其OD595的關(guān)系圖，如圖2。

圖2　蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Thestandard curveof protein determ ination

從圖2可以看出，蛋白質(zhì)量與蛋白的OD595值成正比，R2=0.999 4，線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)中的蛋白含量均通過(guò)圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算。

2.3脂肪酶固定化的單因素試驗(yàn)

2.3.1緩沖液pH對(duì)脂肪酶固定化的影響

在載體/酶液比為25mg/mL、溫度為40℃條件下，分別調(diào)節(jié)緩沖液pH為5、6、7、8、9、10，測(cè)得各pH條件下蛋白固定率和固定化酶酶活，結(jié)果如圖3。

圖3　pH對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.3　Effect of pH on imm obilization of lipase

由圖3可知，D101型大孔樹脂對(duì)酶液中蛋白質(zhì)的固定率和固定化脂肪酶酶活均呈現(xiàn)隨pH升高先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)pH 8時(shí)，二者均達(dá)到最大值，蛋白固定率為62.4%，固定化脂肪酶酶活為33.8U/g。隨著pH繼續(xù)增加固定化酶活迅速減小，可能是由于隨著pH值的增加，酶分子表面離子化程度減低，使得酶分子與載體之間的結(jié)合能力消弱所致。因此，脂肪酶固定化的最佳pH為8。

2.3.2載體/酶液比對(duì)脂肪酶固定化的影響

在pH 8、溫度為40℃條件下，將載體/酶液比分別配制為10、15、20、25、30、35mg/mL，測(cè)得了蛋白固定率和固定化酶酶活，結(jié)果如圖4。

圖4　載體投放量對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.4　Effectof car rier'squantity on imm obilization of lipase

由圖4可知，D101型大孔樹脂對(duì)脂肪酶的固定率和固定化酶活隨載體投放量的增加而上升，載體/酶液比達(dá)到25mg/mL時(shí)，蛋白固定化率上升緩慢，可能是由于大孔樹脂的內(nèi)部孔徑空間被占有，載體固定化的脂肪酶已基本達(dá)到飽和，此時(shí)的固定化酶活為44.1U/g、蛋白固定率為93.5%，再增加載體投放量對(duì)固定化酶酶活無(wú)明顯提高，因此載體/酶液比確定為25mg/mL。2.3.3固定化溫度對(duì)脂肪酶固定化的影響

在緩沖液pH 8、載體/酶液比為25mg/m L條件下，將溫度分別設(shè)為25、30、35、40、45、50℃，測(cè)得了蛋白固定率和固定化酶酶活，結(jié)果如圖5。

圖5　溫度對(duì)脂肪酶固定化的影響Fig.5　Effect of tem peratureon immobilization of lipase

由圖5可知，在溫度較低時(shí)，蛋白的固定率較小，脂肪酶酶活也比較小，隨著溫度的升高蛋白固定率和固定化酶活都逐漸增大，在40℃時(shí)固定化酶活達(dá)到最大值50.1U/g，蛋白固定率也達(dá)到較大值為69.8%，當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，蛋白固定率略有提高，而脂肪酶酶活下降較快，可見高溫導(dǎo)致部分脂肪酶酶活減小或喪失，因此，將固定化的最佳溫度確定為40℃。

2.4正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取緩沖液pH、固定化溫度、載體/酶液比3因素為考察對(duì)象，每因素選取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，其正交試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1　脂肪酶固定化L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果Table1　Resultsoforthogonal test

由表1的正交試驗(yàn)結(jié)果可知：A、B、C三因素的極差值Rj分別為50.26、4.08和9.79，均大于空列的Rj。表明A、B、C 3個(gè)因素的水平試驗(yàn)存在顯著差異性。各因素對(duì)脂肪酶固定化影響的主次關(guān)系為A>C>B，脂肪酶固定化各因素最優(yōu)水平組合為2號(hào)處理，即A1B2C2，對(duì)應(yīng)的固定化條件為：緩沖液pH 7.5，固定化溫度應(yīng)為40℃，載體/酶液比為25mg/m L，在此條件下固定化脂肪酶活力最大達(dá)68.25U/mL。

2.5固定化脂肪酶的水解性質(zhì)研究

2.5.1溫度對(duì)固定化酶和游離酶的水解活力的影響

在pH 7.5、溫度分別為25、30、35、40、45、50、55、60、65℃條件下測(cè)得了固定化酶與游離酶的酶活，結(jié)果如圖6。

從圖6可知，從25℃開始，隨著溫度的增加，游離酶和固定化酶的活性均逐漸增大，固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度都是40℃。超過(guò)最適溫度后，游離酶酶活力隨著溫度升高下降迅速，溫度為65℃時(shí)，游離酶酶活力降到9.8 U/m L；超過(guò)40℃后，固定化酶酶活也開始下降，但趨勢(shì)平緩，溫度為65℃時(shí)，酶活為43.7 U/mL，表明脂肪酶經(jīng)過(guò)固定化處理后，對(duì)高溫的耐受性有較大提高。

2.5.2pH對(duì)固定化酶和游離酶的水解活力的影響

在溫度為40℃，pH分別為4、5、6、7、8、9、10條件下測(cè)得了固定化酶與游離酶的酶活，結(jié)果如圖7。

圖6　溫度對(duì)酶活的影響Fig.6　Effectsof tem peratureon activity of enzymes

圖7　pH對(duì)酶活的影響Fig.7　Effectsof pH on activity ofenzymes

由圖7可知，當(dāng)pH 7時(shí)，游離酶的酶活為62.6 U/mL，固定化酶的酶活為57.9U/g，均達(dá)最高值。當(dāng)pH大于或小于7時(shí)，游離酶酶活力隨pH改變而迅速降低，而固定化酶酶活下降趨勢(shì)較緩。表明固定化酶具有較高的pH穩(wěn)定性，在過(guò)酸或過(guò)堿的情況下較游離酶能保持更大的酶活力。

2.6固定化脂肪酶催化合成生物柴油

2.6.1氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)分析生物柴油

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)固定化脂肪酶催化合成的生物柴油進(jìn)行檢測(cè)分析，其色譜圖如圖8。

通過(guò)分析計(jì)算得知生物柴油產(chǎn)品中脂肪酸甲酯的組成主要為：棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、十七碳酸甲酯、花生酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甲酯。其具體結(jié)果如表2所示。

2.6.2催化反應(yīng)次數(shù)對(duì)生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響

通過(guò)色譜圖計(jì)算生物柴油產(chǎn)品中總脂肪酸甲酯的含量，通過(guò)生物柴油轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式得出不同批次催化反應(yīng)合成生物柴油的轉(zhuǎn)化率，得出催化反應(yīng)次數(shù)對(duì)生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響，結(jié)果如圖9。

圖8　脂肪酶制備生物柴油產(chǎn)品氣相色譜圖Fig.8　GC spectrum ofbiodieselp roductby lipase

表2　生物柴油產(chǎn)品中脂肪酸甲酯的組成Table2　The com position of fatty acidmethylester ofbiodieselp roduct

圖9　反應(yīng)次數(shù)對(duì)生物柴油轉(zhuǎn)化率的影響Fig.9　Effectof the reaction tim esofbiodieselconversion

從圖9可知，經(jīng)D101型大孔樹脂固定的脂肪酶催化合成生物柴油反應(yīng)8次后，轉(zhuǎn)化率仍保持68.6%以上，具有較高的催化活性，轉(zhuǎn)化率僅降低為8.5%，操作穩(wěn)定性較強(qiáng)。因此，脂肪酶固定化對(duì)于生物柴油的生物合成具有很大的應(yīng)用潛力。

3　討論與展望

從實(shí)驗(yàn)可以得出，脂肪酶固定化的最佳條件為：緩沖液pH 7.5，固定化溫度應(yīng)為40℃，載體/酶液比為25mg/mL，在此條件下固定化脂肪酶活力可達(dá)68.25U/mL。固定化酶的最適pH和溫度分別為7和40℃，具有轉(zhuǎn)化率高、催化性高和操作穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

固定化酶法生產(chǎn)生物柴油一般采用以甲醇為酰基受體的醇解法[12]，但高濃度甲醇易使酶失活，且副產(chǎn)物甘油可聚集在固定化酶載體表面，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，所以本研究在反應(yīng)中通過(guò)分批添加甲醇及用有機(jī)溶劑、洗滌除去固定化酶表面的甘油等方法來(lái)提高甲酯產(chǎn)率和酶的操作穩(wěn)定性。反應(yīng)結(jié)束后濾出固定脂肪酶，離心并除去粗甘油，蒸餾除去有機(jī)溶劑，最后采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀檢測(cè)生物柴油的成分及含量。

從本文和其他文獻(xiàn)[13]可知，固定化后酶的穩(wěn)定性有較大提高，對(duì)溫度、pH、有機(jī)溶劑、抑制劑等的適應(yīng)能力增強(qiáng)，可較長(zhǎng)時(shí)間地保持較高的酶活性，反應(yīng)結(jié)束易與產(chǎn)物分開，便于回收，回收后酶仍保持較大活力，可重復(fù)使用，提高了酶的利用率，同時(shí)降低了生產(chǎn)成本，其催化過(guò)程容易掌控，適合于自動(dòng)化、連續(xù)化生產(chǎn)。我國(guó)土地資源資源遼闊，適合種植多種油料作物，在當(dāng)前石化資源越來(lái)越少的情況下，利用植物油料開發(fā)生物柴油具有廣闊的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，掌握了固定化脂肪酶合成生物柴油的關(guān)鍵技術(shù)，必將加快生物柴油大規(guī)模生產(chǎn)進(jìn)程，為緩解我國(guó)燃油緊缺作出貢獻(xiàn)。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.041

收稿日期：2015-04-17

基金項(xiàng)目：四川省教育廳項(xiàng)目（14ZA0206）；綠色催化四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（LYJ1304）；四川理工學(xué)院科研項(xiàng)目（2012PY08）；釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（NJ2012-16）；瀘州老窖科研獎(jiǎng)學(xué)金項(xiàng)目（13ljzk05）

作者簡(jiǎn)介：趙興秀（1977—），女（漢），副教授，碩士，主要從事微生物研究。

Study on Lipase Immobilization and Immobilized Lipase's Application in Synthesisof Biodiesel

ZHAO Xing-xiu，HE Yi-guo，ZHAOChang-qing，F(xiàn)ANGChun-yu，ZHANG Jing，ZOUWei
（Sichuan University of Scienceand Engineering，Zigong643000，Sichuan，China）

Abstract：It was to get the best conditions of lipase immobilization and the conversion rate of biodiesel production.The optimum conditions of lipase immobilization were obtained by single factor experiment and orthogonal test.The main components of the biodiesel were analyzed by the gas chromatograph-mass spectrometer.The optimum conditionsof lipase immobilizationwere obtained thatwas thepH ofbufferwas7.5，the ration of vector：enzyme solution was 25 mg∶1 mL，the immobilized temperature was 40℃.The immobilized enzyme activitywas68.25U/g.With immobilized lipase the conversion rate of biodiesel production wasup to 75%.The result showed that the immobilized lipase had higher catalytic efficiency and its tolerance wasmore improved tohigh-temperature and pH than the freeenzyme.The immobilized lipase had apotential for industrialproduction becauseofitshigh catalytic efficiencyand strong operationalstability.

Key words：lipase；immobilization；macroporous resin；biodiesel