王丹

（第二軍醫(yī)大學基礎部神經生物學教研室，上海200433）

miRNA-145抑制肺癌A549細胞增殖活性的機制

王丹

（第二軍醫(yī)大學基礎部神經生物學教研室，上海200433）

目的：研究miRNA-145（miR-145）抑制肺癌A549細胞增殖活性的機制。方法：應用生物信息學方法預測Sp1基因3′-UTR區(qū)與miR-145的結合位點并通過熒光素酶報告基因法進行驗證；轉染miRNA-145擬似物和阻遏物到A549細胞，實時熒光定量PCR法檢測細胞內miR-145含量，蛋白質印跡法檢測細胞中Sp1蛋白含量；同時采用MTT法檢測轉染后24，48和72 h A549細胞的增殖活性。結果：熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證結果表明，成功預測了miR-145與人Sp1基因3′-UTR區(qū)的結合位點。與單獨轉染組比較，miR-145擬似物和miR-145阻遏物與野生型熒光素酶報告基因共轉染可以明顯抑制或增強熒光素酶活性（P＜0.05）。轉染miR-145擬似物和阻遏物能明顯抑制或者促進A549細胞內Sp1蛋白的表達（P均＜0.05）。實時熒光定量檢測結果表明，轉染后48 h，與轉染對照組比較，擬似物組細胞內miR-145含量明顯上升，而阻遏組細胞內miR-145含量明顯下降（P均＜0.05），陰性對照轉染組和轉染對照組miR-145相對含量間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。細胞活性檢測結果表明，轉染72 h后，擬似物組細胞增殖活性明顯降低，而阻遏組細胞活性明顯增高（P均＜0.05）。結論miR-145通過抑制Sp1基因表達，明顯抑制A549細胞的增殖活性。

轉錄因子Sp1；A549細胞；miR-145；增殖活性

我國每年新發(fā)肺癌約70萬例，對74個城市肺癌抽樣調查顯示，肺癌死亡率占各種惡性腫瘤死亡率的首位［1-2］。因此，尋找潛在的基因靶點和新的治療手段，已成為肺癌治療中迫切需要解決的問題。Sp1基因編碼相對分子質量為105 000的蛋白質，當Sp1蛋白中的激活區(qū)與被調控基因啟動子區(qū)域的DNA結合后，可以影響基因轉錄活性［3］。Sp1與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，在多種腫瘤，如胃癌、胰腺癌、乳腺癌和甲狀腺腫瘤中都有高表達［4-5］。多項研究指出，在同一患者體內，腫瘤組織中的Sp1蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，且與腫瘤侵襲、轉移密切相關［6-7］。Sp1在不同類型腫瘤中異常表達的原因不盡相同，而呈現(xiàn)多樣性。

據(jù)報道，Sp1蛋白在肺癌中高表達［8］，而微小RNA（microRNA，miRNAs）則可通過調控Sp1蛋白影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［9-10］。我們使用生物信息學軟件預測Sp1基因3′-UTR區(qū)可能存在理論靶位的miRNAs，發(fā)現(xiàn)存在miR-145理論結合位點。我們據(jù)此推測，肺癌細胞內Sp1基因高表達可能與miR-145的低表達相關，如果miR-145與Sp1基因具有靶位關系，很可能肺癌細胞中miR-145的低表達會減弱其對Sp1基因的調控作用，這也有可能是腫瘤細胞中Sp1蛋白高表達的原因之一。本實驗擬通過生物信息學軟件預測has-miR-145與人Sp1之間可能存在的靶位關系，并通過熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行驗證；在A549細胞內干預miR-145，觀察Sp1蛋白表達以及細胞增殖能力的變化，進而明確miR-145在肺癌調控中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肺癌A549細胞和293細胞均購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。DMEM高糖細胞培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、Lipofectamine 2000轉染試劑、RNA提取試劑盒（Trizol）及反轉錄試劑盒（M-MLV）均為美國Invitrogen公司產品，熒光素酶報告基因表達載體（pGL3-Promoter）和熒光素酶檢測系統(tǒng)（Promega公司），Sp1蛋白一抗及二抗均為美國Abcam公司產品，細胞總蛋白提取及定量試劑盒、化學發(fā)光試劑盒均為美國Thermo公司產品，miRNA合成、測序均由Invitrogen公司進行，MTT和DMSO為Sigma公司產品。

1.2 儀器和設備

細胞培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產品，水平離心機、高速低溫離心機以及微量移液器為Eppendorf公司產品，電泳儀、垂直電泳槽及轉膜儀購于上海天能公司，酶標儀及紫外分光光度檢測儀為Thermo公司產品，PCR儀為TaKaRa公司產品。

1.3 方法

1.3.1 miR-145靶基因預測 采用TargetScan預測軟件對Sp1（NM_003109）3′-UTR區(qū)進行結構預測，分析是否存在miR-145的結合位點。預測結果顯示（圖1），hsa-miR-145在Sp1的3′-UTR區(qū)存在6個堿基的種子區(qū)。

圖1 hsa-m iR-145與Sp1的靶位關系預測

1.3.2 has-miR-145與Sp1預測靶位關系的驗證

1.3.2.1 熒光素酶報告基因表達載體的構建 取對數(shù)生長期293細胞，Trizol裂解法提取細胞總RNA，反轉錄制備cDNA。針對Sp1基因3′-UTR區(qū)設計PCR引物：上游引物，5′-GCTCTAGATTGTATATCCTATATAGG-3′，下游引物，5′-GCTCTAGAAAGCATAACAGGGGCCTGATT-3′，引物兩端分別添加XbaⅠ酶切位點，PCR擴增包含miR-145靶位5′-ACTGGA-3′在內的219 bp的堿基序列。取2μL cDNA為模板，使用上面引物進行PCR擴增，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)為38個。擴增后使用XbaⅠ對PCR產物進行酶切處理，酶切回收目的片段后克隆至pGL3-Promoter熒光素酶報告基因表達載體，重組載體經序列分析后命名為pGL3-Pro-WT-Sp1。以pGL3-Pro-WT-Sp1為基礎，對miR-145靶位進行點突變，即將5′-ACTGGAA-3′突變?yōu)?′-TGAACAG-3′，構建突變型熒光素酶報告基因表達載體pGL3-Pro-MT-Sp1。對兩組熒光素酶報告基因表達載體進行無內毒素質粒DNA提取。同時，化學法合成miR-145擬似物，miR-145阻遏物和miR-145陰性對照。

1.3.2.2 細胞轉染及熒光素酶活性檢測 選取生長狀況良好且處于對數(shù)生長期的第3代293細胞，用胰酶消化并制備細胞懸液，臺酚藍染色后使用血細胞計數(shù)板進行活細胞計數(shù)，使用完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）調整細胞密度為1×105個/mL，將細胞接種到6孔板，每孔加2 mL細胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，參照Lipofectmaine 2000轉染試劑說明書進行質粒和RNA共轉染。轉染分為9組：293細胞對照組，293細胞+pGL3-WT組，293細胞+pGL3-MT組，293細胞+NC+pGL3-WT組，293細胞+NC+pGL3-MT組，293細胞+ miR-145擬似物+pGL3-WT組，293細胞+miR-145擬似物+pGL3-MT組，293細胞+miR-145阻遏物+pGL3-WT組，293細胞+miR-145阻遏物+pGL3-MT組。同時每組細胞轉染100 ng的海腎熒光素酶（pGL-TK）作為熒光霉素活性的檢測參照。轉染后48 h，使用Promega公司的雙熒光素酶檢測系統(tǒng)和熒光素酶檢測儀檢測熒光素酶含量。

1.3.3 轉染miR-145對肺癌A549細胞株胞內Sp1蛋白表達的影響

1.3.3.1 細胞轉染 取對數(shù)生長期的A549細胞，胰酶消化后1 000×g離心2 min收集細胞，用含10%FBS的DMEM重懸細胞，調整細胞密度至1× 105個/mL，接種細胞到6孔細胞培養(yǎng)板，每孔添加2 mL細胞懸液，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。轉染過程按照Lipofectmaine 2000說明書進行。實驗分為4組，即轉染對照組（只加轉染試劑），陰性對照（negative-control，NC）序列轉染組，miR-145擬似物轉染組（擬似組）和miR-145阻遏物轉染組（阻遏組）。

1.3.3.2 蛋白質印跡法檢測Sp1的表達量 轉染后48 h，去掉細胞培養(yǎng)基，每孔加入1 mL無菌PBS洗細胞2遍，加入0.5 mL細胞裂解液，按照試劑盒說明書提取細胞總蛋白，BCA法定量細胞總蛋白濃度。定量后的細胞總蛋白以每組10μL進行垂直電泳，SDS-PAGE分離膠濃度為10%，110 V電泳90 min后，立春紅染色觀察蛋白條帶是否完整，400 mA轉膜90 min，轉膜后以5%脫脂牛奶封閉2 h，4℃一抗孵育過夜，Sp1和GAPDH一抗稀釋（TBST）比分別為1∶300和1∶1 000；TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，羊抗鼠二抗稀釋比為1∶4 000；TBST洗膜3次，添加化學發(fā)光液反應底物，暗室曝光，掃描曝光底片，統(tǒng)計目的條帶光密度值（D值）。D值目的蛋白/D值GAPDH，即為Sp1蛋白的相對含量。

1.3.3 A549細胞增殖活性的檢測 轉染后48 h，胰酶消化法制備A549細胞懸液，離心收集細胞沉淀，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基調整細胞密度至1×105個/mL，接種細胞到96孔細胞培養(yǎng)板，每孔添加100μL細胞懸液，輕晃培養(yǎng)板使其分布均勻，37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)細胞，并于接種后的24，48和72 h，采用MTT法檢測細胞活性。檢測前，每孔細胞加入5mg/mLMTT溶液10μL，輕晃使其分布均勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去上清，每孔加入150μL DMSO溶液，37℃孵育15 min，酶標儀檢測570 nm波長細胞液的D值，根據(jù)D值制作細胞對數(shù)期生長曲線。

1.3.4 轉染后細胞內miR-145含量檢測 細胞樣本獲取的時間點與MTT檢測時間點一致，細胞培養(yǎng)使用6孔板，接種密度為2×105個/孔。細胞收集前，每孔使用4℃預冷的無菌PBS洗去細胞表面殘留的培養(yǎng)液及血清；去掉PBS，每孔加入1 mL 4℃預冷的Trizol細胞裂解液，震蕩培養(yǎng)板充分裂解細胞，4℃，12 000×g離心5 min，將分層后的溶液上清轉移到無菌1.5 mL離心管，酚氯仿法抽提RNA，得到沉淀后用20μL DEPC溶解，瓊脂糖凝膠電泳觀察RNA純度及完整性，紫外分光光度計測定RNA濃度。取2μg的總RNA，反轉錄制備cDNA，特異反轉錄引物：H.sapiens 6 snRNA：5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′，miR-145：5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAAGGGAT-3′，取2μL反轉錄產物作為PCR反應模板，熒光定量法檢測miR-145含量。2ΔΔCt法分析定量結果，內參選用U6（NM_001101.3）。PCR反應引物序列：U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，下游引物5′-TACCTTGCGAAGTGCTTAAAC-3′；miR-145上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTGGCTC-3′，下游引物5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。PCR反應使用20μL體系，其中，SYBR Premix Ex Taq 10μL，引物（20μmol/L）各取0.2μL，模板使用量為2μL，反應體系用無菌水補足。PCR反應條件：95℃變性10 s；58℃退火10 s；72℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)設置為40。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 has-miR-145與Sp1靶位關系驗證

2.1.1 熒光素酶報告基因表達載體構建 通過PCR擴增得到特異的PCR產物，經過與DNA標準參照物比對，其長度與理論值（219 bp）完全相符（圖2）。成功構建野生型熒光素酶報告基因表達載體，并通過點突變成功構建突變型熒光素酶基因表達載體，測序分析結果顯示，與標準序列完全一致（圖3）。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳PCR產物

圖3 野生型、突變型熒光素酶報告基因表達載體序列分析

2.1.2 轉染后各組細胞的熒光素酶活性 9組293細胞轉染48 h后，熒光素酶相對活性檢測結果顯示，與野生型報告基因單獨轉染組（293+pGL3-WT）比較，miR-145-擬似物（293+pGL3-WT+miR-145擬似物）能夠明顯抑制野生型熒光素酶報告基因表達載體的熒光素酶活性（P＜0.01），而miR-145阻遏組（293+pGL3-WT+miR-145阻遏物）野生型熒光素酶報告基因表達載體的熒光素酶活性則明顯上升（P＜0.01）。突變性熒光素酶報告基因表達載體單獨轉染組（293+pGL3-MT）與miR-145擬似物共轉染組（293+pGL3-MT+miR-145擬似物）熒光素酶活性間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），miR-145阻遏物轉染（293+pGL3-MT+miR-145阻遏物）對突變型熒光素酶報告基因活性也無明顯影響（P＞0.05）；miR-145-NC與pGL3-WT共轉染組（293+ pGL3-WT+miR-145-NC）對野生型熒光素酶報告基因表達載體轉染組熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05），miR-145-NC與pGL3-MT共轉染組（293+ pGL3-MT+miR-145-NC）對突變型熒光素酶報告基因表達載體轉染組熒光素酶活性亦無明顯影響（P＞0.05），說明RNA轉染本身對熒光素酶活性無影響。以上數(shù)據(jù)和結果說明，has-miR-145與Sp1基因之間的預測靶位確實存在。見圖4。

圖4 9組293細胞的熒光素酶相對活性的比較

2.2 轉染后各組A549細胞內Sp1蛋白的含量

蛋白質印跡法檢測結果顯示，轉染48 h后，與轉染對照組比較，阻遏組細胞內Sp1蛋白含量明顯增加（P＜0.05），而擬似組細胞內Sp1蛋白含量明顯降低（P＜0.01）。轉染對照組與陰性序列轉染組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明Lipofectamine 2000轉染試劑及轉染過程對A549細胞內Sp1蛋白表達無明顯影響。見圖5。

圖5 4組A549細胞中Sp1蛋白的表達

2.3 miR-145含量變化對A549細胞增殖活性的影響

細胞活性檢測結果（圖6）顯示，轉染后48 h和72 h，與轉染對照組比較，擬似組A549細胞增殖活性明顯降低（P＜0.05和0.01），而阻遏組細胞增殖活性在轉染72 h后，明顯高于轉染對照組（P＜0.05）。轉染后24，48和72 h，收集細胞，使用實時熒光定量PCR檢測轉染后miR-145含量。結果顯示，轉染后各個時間段，擬似組細胞內的miR-145表達量均明顯高于轉染對照組（P均＜0.05）。而阻遏組miR-145的表達均明顯低于轉染對照組（24 h和72 h時P＜0.05，48 h時P＜0.01）。陰性對照組和轉染對照組3個時間點miR-145表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖6 m iR-145含量變化對A549細胞增殖活性的影響

3 討論

miRNAs是一類分布廣泛的內源性非編碼RNA，核酸長度一般為20～25個堿基。miRNAs具有高度保守的遺傳學特性，通過與基因3′-UTR區(qū)的靶點結合，對基因進行轉錄后調控［11］。miRNA的表達與多種腫瘤的進展及預后相關，可作為腫瘤的標志分子［12-15］。研究顯示，固有的miRNA調控機制失常是多種腫瘤中癌基因及抑癌基因異常表達的內在原因［16-17］。

Sp1是存在于哺乳動物細胞中的一種基因調控蛋白，特異性地結合在受調控的基因啟動子區(qū)域，選擇性活化啟動子引導的基因轉錄。Sp1在多種腫瘤中高表達，并與腫瘤浸潤、轉移及患者預后差等密切相關，提示Sp1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中亦起重要作用。針對Sp1的研究，多以Sp1作為轉錄因子對其下游基因的轉錄后調控展開，而對于Sp1蛋白本身異常的原因，目前尚未見報道。尋找Sp1在腫瘤中異常的原因，才能追根溯源，為腫瘤的基因治療提供理論基礎。近幾年來miRNAs與腫瘤的關系始終是腫瘤研究領域的熱點，已有報道顯示miRNAs通過Sp1對多種腫瘤產生調控作用［18-20］。鑒于miR-145與Sp1在A549細胞中表達具有顯著相關性，我們有理由相信，miR-145可能通過對Sp1的表達調控影響肺癌細胞A549的生物學功能。

本研究在miR-145與Sp1表達具有相關性的基礎上，通過生物信息學方法尋找兩者的結合位點，并通過熒光素酶報告基因實驗進行位點驗證。在此基礎上，嘗試通過干預miR-145含量肺癌細胞產生影響的作用途徑，并最終通過miRNA調控理論來解釋miR-145-Sp1與A549細胞之間的關系。研究中，首先利用miRNA靶位的生物學預測在線軟件TargetScan進行分析，發(fā)現(xiàn)在Sp1的3′-UTR有兩處位置存在hsa-miR-145的結合位點，位于序列保守區(qū)（3′-UTR的第3481-3487位）。進一步通過熒光素酶報告基因驗證預測的理論幾何位點，miR-145可以通過其位于保守區(qū)的結合位點，結合于3′-UTR，并對其上游基因翻譯產生抑制作用。而非保守區(qū)位點為無效位點，之所以出現(xiàn)這樣的原因，可能與位點所處位置有關，另外，從miRNA進化角度考慮，其對于靶基因結合區(qū)域的物種間保守性也是要求較高的。

本實驗通過脂質體轉染法轉染miR-145擬似物和阻遏物到A549細胞，Sp1蛋白含量檢測結果說明，通過質粒轉染的方法可以在A549細胞中抑制或增強Sp1蛋白的表達。其中擬似物轉染組胞內Sp1蛋白含量較轉染對照組明顯下降，而阻遏物轉染組細胞內Sp1蛋白含量較轉染對照組明顯上升。細胞增殖活性檢測結果則表明，過表達miR-145可明顯抑制細胞增殖活性，抑制miR-145則增強腫瘤細胞增殖活性。miR-145含量檢測結果顯示，在轉染后48 h，擬似物轉染組細胞內miR-145成熟體含量明顯上升，而阻遏物轉染組細胞內miR-145含量則較轉染對照組明顯下降。這些實驗結果和數(shù)據(jù)提示，miR-145的異常表達可能是A549細胞中Sp1基因異常的關鍵原因。事實上，通過干預腫瘤細胞內miR-145的含量改變Sp1蛋白表達，從而調節(jié)腫瘤細胞A549的增殖也經本實驗證實。本研究的意義在于證實miR-145是肺癌細胞中Sp1基因異常表達的主要調控因素之一，這為以新的基因為靶點的藥物開發(fā)提供了思路。

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M echanism ofm iRNA-145 inhibits cell proliferation of A549 cells

WANG Dan
（Department of Neurobiology，the Second Military Medical University，Shanghai200433，China）

Objective：To investigate the mechanism underlying how miR-145 inhibits cell proliferation in A549 cells.M ethods：The putativemiR-145 binding sites in the 3′-UTR region of Sp1 gene were predicated by bioinformatics and was predicted by a luciferasemethod.miR-145 levelsweremeasured by qPCR and Sp1 protein levels weremeasured by Western blotting after transiently transfected with eithermiR-145 mimics or inhibitors into A549 cells.MTT assayswere employed to evaluate cell proliferation in A549 cells simultaneously at 24，48 and 72 h after transfection.ResultsThrough report of luciferase analysis，the study successfully predicted and verified the putative miR-145 binding site in the 3′-UTR of human Sp1 gene.The luciferase activity of the wild type is reported that it could be significantly reduced and induced 48 h post-transfection ofmiR-145 mimics and inhibitors respectively and it had significant difference between the above two groups（P＜0.05）.Compared to the control，transfection ofmiR-145 mimics ormiR-145-inhibitors reduced or induced Sp1 protein levelswith the significant difference（P＜0.05）.Data from real-time qPCR indicated that transfection ofmiR-145-mimics and inhibitors induced and reduced miR-145 levels respectively compared to the negative control with a significant difference（P＜0.05）.There was no significant difference between the negative control transfection group and transfection control group（P＞0.05）.Finally，transfection ofmiR-145-mimics and miR-145-inhibitor could significantly reduce and induce cell proliferation of A549 cells.Seventy-two hours post transfection，there had significant difference betweenmiR-145-mimics transfection group and the negative control transfection group（P＜0.05）.Conclusion：miR-145 inhibited cell proliferation of A549 cells through reducing Sp1 gene expression.

book=312,ebook=41

Sp1 transcription factor；A549 cell；miR-145；cell proliferation

R734.2

A

1671-7783（2015）04-0311-06

10.13312/j.issn.1671-7783.y150041

王丹（1980—），女，遼寧大連人，助理實驗師，主要從事膠質環(huán)境與神經再生研究。

2015-03-06 ［編輯］陳海林