吳晶晶，仝佳，陳娟，袁靖，田潔，湯新逸，王勝軍

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

GITRL基因SNP-rs2236876分型方法的比較

吳晶晶，仝佳，陳娟，袁靖，田潔，湯新逸，王勝軍

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：對(duì)3種單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism，SNP）分型方法進(jìn)行比較，選擇準(zhǔn)確有效的SNP分型方法對(duì)GITRL SNP-rs2236876A/G進(jìn)行基因分型。方法：采用Taqman-MGB探針?lè)ǎ拗菩云伍L(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）法和直接測(cè)序法對(duì)GITRL SNP-rs2236876A/G進(jìn)行分型并比較。結(jié)果：PCR-RLFP法分型結(jié)果直接通過(guò)電泳圖可見(jiàn)，適合少量的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；Taqman-MGB探針?lè)ㄍㄟ^(guò)不同的熒光區(qū)分不同的基因型，適合大量的實(shí)驗(yàn)對(duì)象；直接測(cè)序法交由測(cè)序公司測(cè)定，樣本數(shù)量浮動(dòng)范圍較大，費(fèi)用較高。結(jié)論：Taqman-MGB探針?lè)ㄟm用于GITRL基因rs2236876A/G基因分型，PCR-RFLP法適用于基因分型結(jié)果的驗(yàn)證，直接測(cè)序法適用于鑒定有爭(zhēng)議的PCR-RFLP法的驗(yàn)證結(jié)果。

Taqman-MGB探針；單核苷酸多態(tài)分型；PCR-RFLP；GITRL

快速經(jīng)濟(jì)地對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體配體（GITRL）基因SNP-rs2236876進(jìn)行分型，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究SNP而言非常重要。目前，SNP分型的方法有多種，如探針?lè)?，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites，PCR-RFLP）等，為了配合研究SNP的大量樣本分析，我們需要一種經(jīng)濟(jì)、精確、有效的SNP分型方法。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料 常規(guī)PCR試劑（TaKaRa公司），PCRRFLP所用TaiⅠ限制性內(nèi)切酶（TaKaRa公司），Taqman-MGB探針?biāo)玫慕M分（上海閃晶）。

1.1.2 儀器 定量PCR擴(kuò)增儀CFX 96 Real Time system（Bio-Rad公司），凝膠成像及分析系統(tǒng)（北京賽智公司），電泳儀（Bio-Rad公司），低溫臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2 方法

1.2.1 確立用于比較實(shí)驗(yàn)方法的標(biāo)準(zhǔn)品 提取10例不同個(gè)體的外周血基因組DNA，提取方法參考文獻(xiàn)［1］。對(duì)GITRL基因SNP-rs2236876A/G進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)的原則是將rs2236876A/G突變的位點(diǎn)包含在PCR產(chǎn)物內(nèi)，并保證與引物上下端有一定的距離。PCR-RFLP所設(shè)計(jì)的引物序列見(jiàn)表1。用引物對(duì)所提取的10例基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR，產(chǎn)物交由上海英濰捷基公司測(cè)序，分析PCR結(jié)果，選擇rs2236876A/G 3種不同基因型（AA，AG，GG）的樣本作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行下一步分析。

表1 PCR-RFLP與Taqman-MGB探針的引物序列

1.2.2 基因分型方法

1.2.2.1 PCR-RFLP法［2］將選出的3例不同基因型的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行常規(guī)PCR，針對(duì)rs2236876A/G選擇能識(shí)別于該位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶TaiⅠ，然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，酶切結(jié)果行瓊脂糖凝膠電泳，然后EB染色，最后在紫外凝膠成像儀中觀察酶切結(jié)果，根據(jù)酶切結(jié)果的不同進(jìn)行基因分型。具體反應(yīng)體系如下：10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μL、dNTP 1.6μL、上游引物0.4μL、下游引物0.4 μL、DNA聚合酶0.2μL。

1.2.2.2 Taqman-MGB探針?lè)ǎ?］設(shè)計(jì)Taqman-MGB探針?lè)ㄋ璧囊锛疤结?，引物和探針序列?jiàn)表1。在熒光定量PCR儀上選擇兩種熒光（FAM，VIC）進(jìn)行基因分型。具體反應(yīng)體系如下：雙蒸水8 μL、TaqMan?SNP探針0.5μL、TaqMan?SNP引物0.5μL、TaqMan?Genotyping Master Mix 10μL、模板1.0μL。

1.2.2.3 直接測(cè)序法 將PCR產(chǎn)物直接送至上海英濰捷基公司進(jìn)行直接測(cè)序，獲得結(jié)果后，通過(guò)Chromas軟件進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的分析。將分析結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)基因型。

2 結(jié)果

2.1 PCR-RFLP法進(jìn)行基因分型的結(jié)果

由圖1可見(jiàn)3種不同的酶切結(jié)果，rs2236876GG樣本被完全酶切，rs2236876AG樣本部分被酶切，而rs2236876AA樣本完全未被酶切，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 PCR-RFLP法對(duì)GITRL基因rs2236876進(jìn)行基因分型的結(jié)果

2.2 Taqman-MGB探針?lè)ㄟM(jìn)行基因分型的分型圖譜

根據(jù)FAM和VIC兩種不同的熒光與不同基因型的結(jié)合分析，方塊點(diǎn)所代表的基因型是rs2236876-GG，三角形點(diǎn)所代表的基因型是rs2236876-AG，圓形點(diǎn)所代表的基因型是rs2236876-AA，與預(yù)期結(jié)果相符合。見(jiàn)圖2。

圖2 Taqman-MGB探針?lè)▽?duì)GITRL基因rs2236876進(jìn)行基因分型的熒光分型圖

2.3 直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型的測(cè)序結(jié)果

從圖3中序列的峰圖譜可看出，在rs2236876A/ G位點(diǎn)處可見(jiàn)3種不同的峰圖譜，rs2236876AG所對(duì)應(yīng)的峰圖譜中可見(jiàn)兩種不同顏色的混合峰，而rs2236876GG和rs2236876AA分別對(duì)應(yīng)的是不同顏色的單一峰，與預(yù)期結(jié)果相符合。

圖3 直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型的測(cè)序結(jié)果分析圖譜

2.4 3種基因分型方法的費(fèi)用和耗時(shí)比較

預(yù)估計(jì)實(shí)驗(yàn)所要檢測(cè)約400個(gè)樣本的SNP，因此需要考慮費(fèi)用和時(shí)間各方面因素，故需選擇一種經(jīng)濟(jì)、快捷、準(zhǔn)確性較高的基因分型方法。綜合考慮，對(duì)3種不同的基因分型方法從費(fèi)用和耗時(shí)的角度進(jìn)行了比較，見(jiàn)表2。由表可知，PCR-RFLP法進(jìn)行基因分型費(fèi)用低，但耗時(shí)較長(zhǎng)；TaqMan-MGB法費(fèi)用較高，但耗時(shí)很短；直接測(cè)序法費(fèi)用較高，耗時(shí)較長(zhǎng)。

表2 不同基因分型方法的費(fèi)用和時(shí)間比較

3 討論

目前對(duì)基因多態(tài)性的研究越來(lái)越多，臨床上多種疾病都與SNP有關(guān)。多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都配有基因直接測(cè)序的儀器，而對(duì)無(wú)直接測(cè)序儀器的實(shí)驗(yàn)室而言，若要研究SNP，則需要找到一種高效、經(jīng)濟(jì)的基因分型方法。

作為第3代遺傳標(biāo)記的SNPs是基因組變異最常見(jiàn)的一種形式，大規(guī)模SNPs的鑒定和SNPs公共數(shù)據(jù)庫(kù)的建立大大促進(jìn)了復(fù)雜性疾病相關(guān)基因研究的發(fā)展［4］。研究證實(shí)，SNPs與消化道腫瘤有密切的關(guān)系［5］。此外，對(duì)于GITRL與腫瘤關(guān)系的研究亦是熱點(diǎn)，考慮到GITRL與疾病有密切的關(guān)系［6］，本實(shí)驗(yàn)室擬從GITRL基因組學(xué)的角度分析其與疾病間的關(guān)系，從而為疾病的鑒定及治療提供可能的依據(jù)［7］。

近幾年來(lái)，GITR及其配體GITRL在抗腫瘤免疫中的作用引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其是通過(guò)調(diào)控GITR/GITRL系統(tǒng)作為一種治療腫瘤的新途徑的理念更是成為關(guān)注焦點(diǎn)。研究報(bào)道，GITRL基因SNP-rs2236876與過(guò)敏性哮喘有關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)GITRL基因rs2236876A/G進(jìn)行基因分型方法的比較，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的情況，選擇了Taqman-MGB探針?lè)?、PCR-RFLP法、直接測(cè)序法進(jìn)行基因分型比較。我們發(fā)現(xiàn)采用PCR-RFLP法進(jìn)行基因分型費(fèi)用低，但耗時(shí)較長(zhǎng)，且步驟較為煩瑣；此外，雖然基因型能直接在瓊脂糖凝膠電泳中鑒別出來(lái)，但易受客觀因素（如PCR、電泳等）影響；Taqman-MGB法費(fèi)用較高，但耗時(shí)很短，可在1 d之內(nèi)檢測(cè)出500例樣本的SNP；直接測(cè)序法需要交由專(zhuān)業(yè)的公司測(cè)定，費(fèi)用較高，耗時(shí)較長(zhǎng)，得到結(jié)果后仍要做峰狀圖譜的分析，在本實(shí)驗(yàn)中不適用。

因此，我們選擇了Taqman-MGB探針?lè)ㄗ鳛镚ITRL基因rs2236876A/G基因分型的方法，將PCR-RFLP作為基因分型結(jié)果的驗(yàn)證方法，另外將直接測(cè)序法作為有爭(zhēng)議的PCR-RFLP結(jié)果的確定方法。

［1］ 趙嘉慧，張華屏.外周血DNA提取方法的比較及改良［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（1）：12-13.

［2］ Miao YZ，Xu H，F(xiàn)ei BJ，et al.PCR-RFLP analysis of the diversity of phytate-degrading bacteria in the Tibetan Plateau［J］.Can JMicrobiol，2013，59（4）：245-251.

［3］ Huang J，Gao C，Ding X，et al.MGB-based one-step multiplex real-time PCR method for rapid detection of HPV［J］.Cancer Biomark，2012，12（3）：107-113.

［4］ Baeten D，Van Damme N，Van den Bosch F，etal.Impaired Th1 cytokine production in spondyloarthropathy is restored by anti-TNFα［J］.Ann Rheum Dis，2001，60（8）：750-755.

［5］ Demontis D，Pertoldi C，Loeschcke V，et al.Efficiency of selection，asmeasured by single nucleotide polymorphism variation，is dependent on inbreeding rate in Drosophila melanogaster［J］.Mol Ecol，2009，18（22）：4551-4563.

［6］ Mosbruger TL，Duggal P，Goedert JJ，etal.Large-scale candidate gene analysis of spontaneous clearance of hepatitis C virus［J］.J Infect Dis，2010，201（9）：1371-1380.

［7］ Chattopadhyay K，Ramagopal UA，Mukhopadhaya A，et al.Assembly and structural properties of glucocorticoidinduced TNF receptor ligand：implications for function［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（49）：19452-19457.

［8］ Bottema RW，Postma DS，Reijmerink NE，et al.Interaction of T-cell and antigen presenting cell co-stimulatory genes in childhood IgE［J］.Eur Respir J，2010，35（1）：54-63.

Com parison ofmethod for GITRL SNP-rs2236876 genotyping

WU Jing-jing，TONG Jia，CHEN Juan，YUAN Jing，TIAN Jie，TANG Xin-yi，WANG Sheng-jun
（Institute of Laboratory Medicine，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：Comparing three single nucleotide polymorphism（SNP）genotypingmethods，to choose an accurate and effective SNP genotypingmethod for rs2236876A/G of GITRL gene.M ethodsSNP genotyping for rs2236876A/G of GITRL were performed and compared by Taqman-MGB probe，the PCRRLFP and direct sequencing.Results：PCR-RLFP showed the genotyping result by electrophoresis，which was suitable for a small number of experimental subjects.Taqman-MGB probe showed the genotyping result by fluorescence，which was suitable for a large number of experimental subjects.Direct sequencingmethod was operated by the sequencing company which was expensive.Conclusion：For rs2236876A/G of GITRL gene，Taqman-MGB probemethod could be chosen for genotyping，PCR-RFLPmethod confirmed the genotyping results and，at the same time，the direct sequencing finally validated the result of PCR-RFLP.

Taqman-MGB probe；SNP genotyping；PCR-RFLP；GITRL

R393

A

1671-7783（2015）04-0308-03

10.13312/j.issn.1671-7783.y130120

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81072453，31170849，30972748）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK2011472）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（CXLX11_0608）；江蘇省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（Z201313）；江蘇省“青藍(lán)工程”項(xiàng)目；江蘇大學(xué)“拔尖人才工程”和高級(jí)人才基金項(xiàng)目

吳晶晶（1988—），女，碩士研究生；王勝軍（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：sjwjs@mail.ujs.edu.cn

2013-06-04 ［編輯］ 劉星星