趙義，張尤歷，張行行，王國英，龔愛華，劉鑫，徐岷

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

長鏈非編碼RNA UCA1對胰腺癌PANC-1細胞系侵襲轉(zhuǎn)移的影響

趙義1，張尤歷1，張行行1，王國英1，龔愛華2，劉鑫1，徐岷1

（1.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：探討尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）在胰腺癌細胞中的表達及其對胰腺癌PANC-1細胞系侵襲轉(zhuǎn)移的影響。方法用熒光定量PCR法檢測4種胰腺癌細胞系中UCA1的表達水平，選取PANC-1細胞系，將其隨機分為對照組和實驗組，對照組細胞轉(zhuǎn)染空載Vector，實驗組細胞轉(zhuǎn)染UCA1表達質(zhì)粒，比較兩組細胞UCA1表達水平；Transwell遷移實驗和Transwell侵襲實驗分別檢測兩組細胞遷移和侵襲能力；蛋白質(zhì)印跡檢測兩組細胞MMP14、MMP2和MMP9蛋白表達。結(jié)果：UCA1差異性表達于4種胰腺癌細胞系中；與對照組相比，實驗組細胞的遷移和侵襲能力明顯增強（P＜0.01），細胞中MMP14、MMP2和MMP9的蛋白表達水平均明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論：上調(diào)UCA1促進胰腺癌PANC-1細胞的體外侵襲轉(zhuǎn)移。

胰腺癌；腫瘤轉(zhuǎn)移；長鏈非編碼RNA；尿路上皮癌抗原1

胰腺癌是致死性最強的實體腫瘤之一，約40%患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移［1］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）雖無編碼蛋白質(zhì)的功能，卻以RNA的形式參與調(diào)控染色體沉默、細胞分化、細胞凋亡和腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過程［2］。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［3］，如H19［4］和MALAT-1［5］可促進胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。

尿路上皮癌抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）是一種膀胱癌特異性lncRNA［6］。研究發(fā)現(xiàn)UCA1在食管癌［7］、肝癌［8］和結(jié)直腸癌［9］等消化道腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用。Yang等［10］研究指出UCA1可能與胰腺癌有一定的關(guān)系。但是，UCA1在胰腺癌中的表達及其可能的作用尚不清楚。因此，本研究擬初步探討UCA1在胰腺癌細胞系中的表達及其對PANC-1細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM、FBS（美國Gibco公司），MillicellRHanging Cell Culture Inserts（美國Millpore公司），BD BioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber（美國BD公司），Trizol試劑（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司），基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetallopeptidase，MMP）14、MMP2、MMP9和β-肌動蛋白單克隆抗體（美國Affinity公司），UCA1表達質(zhì)粒和相應(yīng)的空載Vector由美國密西西比大學(xué)Mo Yin-Yuan教授惠贈。

1.2 細胞培養(yǎng)

胰腺癌PaTu8988、BxPC-3、SW1990、和PANC-1細胞系由本實驗室凍存。用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃含5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)人胰腺癌細胞系。

1.3 提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR

收集對數(shù)增殖期的細胞，用預(yù)冷PBS清洗3遍，按照Trizol說明書提取細胞總RNA，蛋白核酸分析儀檢測其純度及濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板擴增U6和UCA1。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)。用2-ΔΔCt計算基因的相對表達量（RQ值），計算公式為RQ=2-ΔΔCt，ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參，ΔΔCt= ΔCt實驗-ΔCt對照。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

將細胞隨機分為對照組和實驗組，對照組細胞轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒，實驗組細胞轉(zhuǎn)染UCA1表達質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染前1天將PANC-1細胞接種至6孔培養(yǎng)板，每孔5×105個細胞，保證細胞在24 h內(nèi)匯合度達到80%～90%。按照LipofectamineTM2000說明書操作，將質(zhì)粒和LipofectamineTM2000分別加入250μL Opti-MEM中，室溫靜置5 min，將二者混合，輕柔混勻，靜置20 min后將500μL質(zhì)粒/LipofectamineTM2000混合物逐滴滴入6孔培養(yǎng)板，于培養(yǎng)箱中孵育48～72 h后進行后續(xù)實驗。

1.5 Transwell遷移實驗和侵襲實驗

1.5.1 Transwell侵襲實驗 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用無血清DMEM清洗細胞2遍，然后用無血清DMEM重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，在小室下層加入含10%FBS的DMEM，上層則加入200 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱中孵育24 h后取出小室，用干棉簽輕輕擦去小室上層未穿過Matrigel膠的細胞，再用PBS潤濕的棉簽擦拭2遍，小室浸入4%低聚甲醛，室溫固定30～60 min，然后將小室浸入0.1%結(jié)晶紫中染色30～60 min，用PBS清洗小室數(shù)次，室溫風(fēng)干。在200倍顯微鏡下隨機計數(shù)5個視野的細胞數(shù)，所有實驗重復(fù)3次。

1.5.2 Transwell遷移實驗 步驟同侵襲實驗，只是將Matrigel膠包被的小室換成不含膠的小室即可。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞MMP的表達

轉(zhuǎn)染48～72 h后收集細胞，用預(yù)冷PBS清洗3遍，加入適量RIPA/PMSF裂解液，冰上裂解30 min，4℃，14 000×g離心15 min，取上清液。蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛血清白蛋白于搖床上室溫封閉2 h，一抗（β-肌動蛋白稀釋比為1∶20 000，MMP14、MMP2和MMP9稀釋比均為1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；HRP標記的二抗（稀釋比例為1∶5 000）于37℃溫箱中孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)分析處理。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差±s）表示，兩均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UCA1 mRNA在4種胰腺癌細胞系中的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示UCA1差異性表達于4種胰腺癌細胞系中，其中PaTu8988中UCA1相對表達量最低，其次為PANC-1，而BxPC-3中UCA1的水平相對最高，綜合考慮，本實驗選取PANC-1細胞作為研究對象。見圖1。

2.2 UCA1在不同質(zhì)粒中的表達

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，實驗組細胞的UCA1相對表達量（800.86±21.67）明顯高于對照組（1.00，t=-73.84， P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染UCA1質(zhì)粒后，UCA1表達水平升高。

圖1 UCA1 m RNA在4種胰腺癌細胞系中的表達

2.3 上調(diào)UCA1對PANC-1細胞遷移的影響

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，實驗組細胞的遷移細胞數(shù)明顯高于對照組（t=-22.67，P＜0.01），表明上調(diào)UCA1的表達促進PANC-1細胞的遷移。見圖2。

圖2 兩組PANC-1細胞的遷移能力比較

2.4 上調(diào)UCA1對PANC-1細胞侵襲的影響

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，實驗組中穿過Matrigel膠的細胞數(shù)明顯高于對照組（t=-17.43，P＜0.01），表明上調(diào)UCA1的表達促進PANC-1細胞的侵襲。見圖3。

2.5 上調(diào)UCA1對MMP14、MMP2和MMP9蛋白的影響

如圖4所示，實驗組細胞中MMP14、MMP2和MMP9的蛋白水平明顯高于對照組（P均＜0.01），表明上調(diào)UCA1的表達促進MMP14、MMP2和MMP9蛋白的表達。

3 討論

最初研究認為lncRNA是基因轉(zhuǎn)錄過程的“副產(chǎn)物”。近年來，研究指出lncRNA在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后3個層面調(diào)控基因表達，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是腫瘤［11］。其中一些lncRNA如UCA1、PCGEM1和ANRIL等可促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而lincRNA-p21、GAS5和MEG3等作為抑癌基因在腫瘤生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)控作用。UCA1差異性表達于絨毛組織、胎盤組織和各種胎兒器官，在成年組織中不表達，而在多種腫瘤中表達，提示UCA1可能是一種癌胚基因，在胚胎發(fā)育和腫瘤形成中發(fā)揮重要作用［12］。食管癌中高表達的UCA1可促進細胞增殖、遷移和侵襲［7］。Wang等［8］發(fā)現(xiàn)肝癌組織中UCA1表達明顯高于癌旁組織，干擾UCA1的表達可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Han等［9］發(fā)現(xiàn)UCA1過表達促進結(jié)直腸癌細胞的生長并抑制其凋亡，提示UCA1在消化系腫瘤中表現(xiàn)為致癌基因。然而，UCA1在胰腺癌中的表達及其可能的作用還不清楚。

圖3 兩組PANC-1細胞的侵襲能力比較

圖4 兩組細胞MMP14、MMP2和MMP9的表達

本研究結(jié)果表明，UCA1差異性表達于4種胰腺癌細胞系，選取UCA1表達相對較低的PANC-1細胞作為研究對象，轉(zhuǎn)染UCA1表達質(zhì)粒用于上調(diào)PANC-1細胞的UCA1水平；Transwell侵襲實驗和遷移實驗結(jié)果顯示，上調(diào)UCA1后，PANC-1細胞的遷移和侵襲能力明顯增強。Yang等［13］發(fā)現(xiàn)沉默膀胱癌細胞的UCA1表達后，MMP14表達明顯下降。MMP14可活化MMP2和MMP9［14］，而MMP2和MMP9在胰腺癌的轉(zhuǎn)移中起重要作用［15］。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)UCA1后，PANC-1細胞的MMP14、MMP2和MMP9表達均增加。由此可見，UCA1可能通過影響MMP的表達在胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，上調(diào)UCA1通過增加MMP14、MMP2和MMP9的表達促進胰腺癌細胞的遷移和侵襲。胰腺癌的轉(zhuǎn)移機制比較復(fù)雜，本研究僅初步探討UCA1在胰腺癌細胞轉(zhuǎn)移中的作用，關(guān)于UCA1在胰腺癌轉(zhuǎn)移中的調(diào)控作用尚需深入研究，如應(yīng)用RNA pull down實驗檢測UCA1的靶蛋白。隨著研究的不斷深入，UCA1有望成為胰腺癌靶向治療的新位點。

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Influence of long non-coding RNA UCA1 on invasion and metastasis of pancreatic cancer cell line PANC-1

ZHAO Yi1，ZHANG You-li1，ZHANG Xing-xing1，WANGGuo-ying1，GONG Ai-hua2，LIU Xin1，XU Min1
（1.Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001；2.School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the expression of urothelial carcinoma antigen 1（UCA1）in pancreatic cancer cell lines and its influence on the invasion and metastasis of the pancreatic cancer cell line PANC-1.M ethods：The expression level of UCA1 in 4 pancreatic cancer cell lines was detected by realtime PCR.PANC-1 cellswere randomly divided into Vector group and UCA1 group，which was transfected with Vector and UCA1-plasmid，respectively；the UCA1 expression level in two groupswas compared.The ability ofmigration and invasion in vitro in Vector group and UCA1 group weremeasured by Transwellmigration assay and Transwell invasion assay.The protein level of MMP14，MMP2 and MMP9 in two groups was analysed byWestern blotting.Results：UCA1 differentially expressed in 4 pancreatic cancer cell lines.Compared with the Vector group，the ability ofmigration and invasion in UCA1 group were dramatically enhanced（P＜0.01），and the protein level of MMP14，MMP2 and MMP9 in PANC-1 were increased（P＜0.01）.Conclusion：Up-regulation of UCA1 promotes the invasion and metastasis in vitro of PANC-1.

pancreatic cancer；tumormetastasis；long non-coding RNA；urothelial carcinoma antigen 1

R735.9

A

1671-7783（2015）04-0304-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y150081

江蘇省衛(wèi)生廳科研資助項目（H201434）；鎮(zhèn)江市科技支撐計劃資助項目（SH2014024）

趙義（1988—），男，碩士研究生；徐岷（通訊作者），副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：peterxu1974@163.com

2015-04-07 ［編輯］ 劉星星