吳衡

（江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院ICU，江蘇宜興214200）

ADAM17在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響

吳衡

（江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院ICU，江蘇宜興214200）

目的：探討解整合素金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase-17，ADAM17）在人胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖遷移的影響。方法利用實(shí)時(shí)定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)3種人胰腺癌細(xì)胞株內(nèi)ADAM17 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)ADAM17-shRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞株，并篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆細(xì)胞株。在不同濃度（0，30μg/mL）的多西環(huán)素誘導(dǎo)ADAM17-shRNA表達(dá)后，通過CCK-8法和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞的體外增殖、遷移能力。結(jié)果：ADAM17 mRNA及蛋白在人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、SW1990和Patu8988中均有表達(dá)。與未誘導(dǎo)表達(dá)ADAM17-shRNA的對(duì)照組相比，誘導(dǎo)表達(dá)特異性ADAM17-shRNA后，細(xì)胞ADAM17蛋白表達(dá)和體外增殖、遷移能力均受到明顯抑制（均P＜0.05）。結(jié)論：ADAM17在人胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，在其增殖、遷移過程中可能發(fā)揮重要作用。

解整合素金屬蛋白酶17；腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶；胰腺癌；增殖；遷移

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，其發(fā)病率和死亡率近年來明顯上升。由于其診斷和治療都很困難，5年生存率＜1%，是預(yù)后最差的惡性腫瘤之一。解整合素金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase，ADAM17）是一種在體內(nèi)廣泛分布的Ⅰ型跨膜蛋白，是體內(nèi)最主要的TNF-α裂解蛋白酶，能特異性水解跨膜型腫瘤壞死因子-α（TNF-α）前體，使其成為可溶性的TNF-α，體內(nèi)90% TNF-α的裂解依靠其發(fā)揮作用［1-2］，因此最初稱其為腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶。ADAM17在多種惡性腫瘤組織中過度表達(dá)，可反映腫瘤的惡性程度，并在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，與腫瘤患者的預(yù)后關(guān)系密切。本文旨在探討ADAM17在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌PANC1、SW1990和Patu8988細(xì)胞株，人胚腎293T細(xì)胞，慢病毒骨架質(zhì)粒Tet-pLKO-puro（Addgene公司）及包裝質(zhì)粒（PHR′-CMV-8.2△VPR、PHR′-CMV-VSVG）為本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM及胎牛血清（Gibco公司），LipofectamineTM2000試劑（Invitrogen公司），PCR試劑盒及膠回收試劑盒（TaKa-Ra公司），Stbl3超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞，Eco R I、Age I、T4DNA連接酶（Fermentas公司），質(zhì)粒大提及小提試劑盒（Omega公司），嘌呤霉素、多西環(huán)素及MTT（Sigma公司），蛋白酶抑制劑及PVDF膜（德國Roche公司），PMSF、BCA試劑盒（碧云天生物公司），鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白抗體（Bioworld公司），兔抗人ADAM17和pAKT抗體（Cell Signal公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胰腺癌SW1990，PANC1，Patu8988細(xì)胞株于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以2×105個(gè)/mL密度接種于6孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ADAM17 mRNA表達(dá)水平 取上述3種細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行PCR擴(kuò)增。ADAM17引物序列上游：5′-TTATTGGTGGTAGCAGAT-3′；下游：5′-AAGTGTTCCGATAGATGT-3′，產(chǎn)物長度為440 bp。β-肌動(dòng)蛋白上游：5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′；下游：5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′，產(chǎn)物擴(kuò)增長度為218 bp，引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件：95℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，40次循環(huán)。以β-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為內(nèi)參照，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。目的基因相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算公式：2-△△Ct=2-（△Ct目的基因-△Ct標(biāo)準(zhǔn)值），并以SW1990細(xì)胞株ADAM17 mRNA的相對(duì)表達(dá)作為100%。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ADAM17蛋白的表達(dá)按蛋白濃度測(cè)定試劑盒（BCA）說明書操作，測(cè)定上述3種細(xì)胞蛋白濃度。取20μL樣品進(jìn)行SDSPAGE，200 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，兔抗人ADAM17（1∶1 000）一抗、鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（1∶5 000）4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯色攝片。

1.2.4 慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)人ADAM17 mRNA序列，選擇與pLKO.1質(zhì)粒相兼容的ADAM17 shRNA寡核苷酸，sh-ADAM17正義鏈：5′-CCGGCCAGCAGCATTCGGTAAGAAACTCGAGTTTCTTACCGAATGCTGCTGGTTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAACCAGCAGCATTCGGTAAGAAACTCGAGTTTCTTACCGAATGCTGCTGG-3′，含干擾靶序列的DNA寡核苷酸由上海生工生物工程公司合成，用TE液稀釋至1μg/μL，于95℃沸水中加熱5 min，緩慢冷卻至室溫生成雙鏈RNA。慢病毒骨架質(zhì)粒Tet-pLKO-puro經(jīng)Eco RⅠ及AgeⅠ雙酶切，膠回收酶切的骨架質(zhì)粒，與退火形成的雙鏈干擾序列經(jīng)T4DNA連接酶連接，并轉(zhuǎn)入Stbl3超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取3個(gè)單克隆轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行菌液PCR。上游序列：5′-GGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGA-3′；下游序列：5′-TGCCATTTGTCTCGAGGTCG-3′，取陽性菌液再擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行質(zhì)粒小提得到較純的sh-ADAM17慢病毒質(zhì)粒。

1.2.5 慢病毒包裝、收獲 包裝病毒前1天取對(duì)數(shù)生長的人胚腎293T細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，用不含雙抗的10%FBSDMEM培養(yǎng)，第2天匯合度達(dá)60%～70%時(shí)，換無血清DMEM，按sh-ADAM17慢病毒質(zhì)粒∶包裝質(zhì)粒PHR′-CMV-8.2△VPR∶包裝質(zhì)粒PHR′-CMV-VSVG=4μg∶3μg∶1μg的比例用LipofectamineTM2000試劑共同轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞，6 h后換含10%FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。收集48和72 h的病毒上清液，4℃4 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞碎片，分裝于EP管中并于-80℃保存。

1.2.6 誘導(dǎo)穩(wěn)定干擾細(xì)胞株的干擾序列表達(dá)并檢測(cè)干擾效果 感染病毒的前1天取處于對(duì)數(shù)生長期的PANC1和Patu8988細(xì)胞分別種于6孔板內(nèi)，使第2天細(xì)胞匯合度達(dá)60%～70%，感染病毒時(shí)換含聚凝胺的培養(yǎng)液，每孔加入500μL病毒液，使聚凝胺的最終濃度為8μg/mL。37℃、5%CO2中培養(yǎng)1 d，第2天重復(fù)感染1次，第3天用嘌呤霉素的最低篩選濃度進(jìn)行篩選。pLKO-sh-ADAM17細(xì)胞種于6孔板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后，在DMEM中加入30μg/mL的多西環(huán)素處理，同時(shí)將未用多西環(huán)素誘導(dǎo)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后提取蛋白，按BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取20μL樣品進(jìn)行SDSPAGE，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別用兔抗人ADAM17和pAKT（1∶1 000）一抗、鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白（1∶5 000）4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后顯色攝片，分析shRNA對(duì)ADAM17的干擾效果。

1.2.7 誘導(dǎo)ADAM17-shRNA干擾序列的表達(dá)并用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖的變化 取對(duì)數(shù)生長期的PANC1-pLKO-sh-ADAM17和Patu8988-pLKO-sh-ADAM17細(xì)胞，分別以4×104/mL密度接種于96孔板，將細(xì)胞分為兩組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，其中將未用多西環(huán)素誘導(dǎo)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，另一組采用30μg/mL多西環(huán)素誘導(dǎo)。細(xì)胞貼壁后，換含有相應(yīng)濃度多西環(huán)素的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)至第3天，每孔換成含10%CCK8無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育0.5 h后終止培養(yǎng)。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的光密度值（D值）。腫瘤細(xì)胞增殖率（%）=D值誘導(dǎo)組/D值對(duì)照組×100%。

1.2.8 誘導(dǎo)PANC1-pLKO-sh-ADAM17細(xì)胞中干擾序列的表達(dá)并用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移的變化

先用標(biāo)記筆在6孔板背后均勻劃2道橫線，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。在孔中分別接種約5 ×105個(gè)已誘導(dǎo)表達(dá)ADAM17-shRNA干擾序列的PANC1細(xì)胞（按照實(shí)驗(yàn)步驟“1.2.7”提及的方法處理細(xì)胞）。第2天用槍頭垂直于背后的橫線劃痕。用PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在劃痕后0，12以及24 h攝影，觀察劃痕處的細(xì)胞生長狀況并計(jì)算劃痕區(qū)域面積，根據(jù)以下公式計(jì)算：劃痕區(qū)域面積=細(xì)胞未覆蓋劃痕區(qū)域面積/原有劃痕區(qū)域面積×100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)的比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05或P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)

實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，ADAM17在PANC1、SW1990和Patu8988胰腺癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，且在PANC1細(xì)胞株中表達(dá)量最高。見圖1。

圖1 3種未經(jīng)處理的胰腺癌細(xì)胞株中ADAM 17蛋白及mRNA的表達(dá)

2.2 shRNA干擾ADAM17表達(dá)的鑒定及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長的影響

成功構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，用多西環(huán)素誘導(dǎo)ADAM17-shRNA表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果表明pLKO-sh-ADAM17能有效干擾胰腺癌PANC1和Patu8988細(xì)胞株ADAM17蛋白的表達(dá)。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)ADAM17下游節(jié)點(diǎn)分子AKT磷酸化水平也相應(yīng)地下調(diào)。見圖2。細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)顯示，與未誘導(dǎo)表達(dá)ADAM17-shRNA的對(duì)照組比較，誘導(dǎo)組下調(diào)ADAM17的表達(dá)后，PANC1和Patu8988細(xì)胞株增殖率明顯下降（P均＜0.05）。見圖3。

圖2 多西環(huán)素誘導(dǎo)后兩種胰腺癌細(xì)胞株中ADAM 17蛋白的表達(dá)水平

圖3 多西環(huán)素誘導(dǎo)后兩種胰腺癌細(xì)胞株的相對(duì)增殖率

2.3 shRNA干擾ADAM17的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC1遷移能力的影響

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，劃痕后12和24 h，下調(diào)多西環(huán)素組ADAM17的表達(dá)能明顯增加劃痕區(qū)域面積，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表明下調(diào)ADAM17的表達(dá)能抑制PANC1細(xì)胞的遷移。見圖4。

圖4 多西環(huán)素對(duì)PANC1細(xì)胞遷移能力的影響

3 討論

ADAM17屬于解整合素-金屬蛋白酶家族成員，與基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）一樣都屬于含鋅蛋白酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)，具有蛋白剪切酶樣的作用，能使一些與細(xì)胞膜結(jié)合的配體或細(xì)胞因子如TNF-α、雙調(diào)蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）和表皮生長因子（EGF）等脫落［3-5］，并能活化表皮生長因子受體（EGFR），從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生物學(xué)行為。由于這些配體已被證明在腫瘤的形成與進(jìn)展中起重要作用，因此推測(cè)ADAM17分子參與了惡性腫瘤的發(fā)生及侵襲過程［6］。

既往研究發(fā)現(xiàn)ADAM17在胃癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等多種癌細(xì)胞中表達(dá)增高，其可通過EGFRPI3K-AKT信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移［7-9，10］。Kenny等［11］通過siRNA或者腫瘤壞死因子-α轉(zhuǎn)化酶抑制劑下調(diào)ADAM17的表達(dá)，可阻礙雙調(diào)蛋白、TGF-α的脫落和EGFR的活化，從而降低腫瘤的惡性程度。劉宏斌等［10］的研究顯示，食管鱗癌組織中ADAM17 mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常食管黏膜組織；ADAM17的表達(dá)與EGFR表達(dá)呈正相關(guān)，且兩者的表達(dá)是食管鱗癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。

既往有研究顯示［12］，ADAM17在正常胰腺細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，而在胰腺癌細(xì)胞中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)了3種胰腺癌細(xì)胞株中ADAM17蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)，表明ADAM17與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展可能相關(guān)。其次我們通過構(gòu)建sh-ADAM17慢病毒載體，轉(zhuǎn)染PANC1和Patu8988細(xì)胞，并與未誘導(dǎo)表達(dá)ADAM17-shRNA的對(duì)照組比較。結(jié)果顯示，shRNA能有效干擾ADAM17蛋白的表達(dá)，同時(shí)ADAM17下游節(jié)點(diǎn)分子AKT磷酸化水平也相應(yīng)下調(diào)，說明ADAM17的表達(dá)可能通過AKT信號(hào)通路起作用。細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未誘導(dǎo)表達(dá)ADAM17-shRNA的對(duì)照組比較，下調(diào)誘導(dǎo)組PANC1和Patu8988細(xì)胞株ADAM17的表達(dá)能明顯抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步闡明ADAM17對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長的影響，本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，表明下調(diào)PANC1細(xì)胞株ADAM17的表達(dá)能明顯抑制細(xì)胞的遷移。

有文獻(xiàn)報(bào)道［13］，多西環(huán)素具有抑癌作用，但對(duì)胰腺癌是否具有抑制作用未見報(bào)道，且本實(shí)驗(yàn)使用多西環(huán)素作為誘導(dǎo)劑的濃度較低，因此可忽略其對(duì)胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的影響。

綜上所述，ADAM17能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移，ADAM17可能通過AKT信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可作為胰腺癌治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

［1］ Black RA，Rauch CT，Kozlosky CJ，et al.A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-α from cells［J］.Nature，1997，385（6618）：729-733.

［2］ Moss ML，Jin SL，Milla ME，et al.Cloning of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumournecrosis factor-α［J］.Nature，1997，385（6618）：733-736.

［3］ Szlosarek P，Cgarles KA，Balkwill FR.Tumour necrosis factor-αas a tumour promoter［J］.Eur JCancer，2006，42（6）：745-750.

［4］ Scheller J，Chalaris A，Garbers C，et al.ADAM17：amolecular switch to control inflammation and tissue regeneration［J］.Trends Immunol，2011，32（8）：380-387.

［5］ Franovic A，Robert I，Smith K，et al.Multiple acquired renal carcinoma tumor capabilities abolished upon silencing of ADAM17［J］.Cancer Res，2006，66（16）：8083-8090.

［6］ Benarroch EE.ADAM proteins，their ligands，and clinical implications［J］.Neurology，2012，78（12）：914-920.

［7］ Ali N，Knaüper V.Phorbol ester-induced shedding of the prostate cancer marker transmembrane protein with epidermal growth factor and two follistatin motifs 2 is mediated by the disintegrin and metalloproteinase-17［J］.JBiol Chem，2007，282（52）：37378-37388.

［8］ Zheng X，Jiang F，Katakowski M，et al.ADAM17 promotes breast cancer cell malignant phenotype through EGFR-PI3K-AKT activation［J］.Cancer Biol Ther，2009，8（11）：1045-1054.

［9］ Giricz O，Calvo V，Peterson EA，et al.TACE-dependent TGFαshedding drives triple-negative breast cancer cell invasion［J］.Int J Cancer，2013，133（11）：2587-2595.

［10］ 劉宏斌，楊其昌，沈屹，等.去整合素-金屬蛋白酶17 mRNA和蛋白在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中華腫瘤雜志，2013，35（5）：361-365.

［11］ Kenny PA，BissellMJ.Targeting TACE-dependent EGFR ligand shedding in breast cancer［J］.J Clin Invest，2007，117（2）：337-345.

［12］ 張建成，康誼，吳剛，等.去整合素和金屬蛋白酶17調(diào)控胰腺癌細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制［J］.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（10）：1716-1719.

［13］ 許敏，李紅.強(qiáng)力霉素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及Notch1、MMP-9表達(dá)的影響［J］.天津醫(yī)藥，2014，42（6）：533-535.

Expression of ADAM 17 and its effect on proliferation and m igration in pancreatic cancer cell

WU Heng
（Department of Intensive Care Unit，the Affiliated Yixing Hospital of Jiangsu University，Yixing Jiangsu 214200，China）

Objective：To investigate the expression of a disintegrin and metalloproteinase-17（ADAM17）of human pancreatic cancer cell and it′s effect on proliferation and migration in human pancreatic cancer cell.M ethods：The protein and mRNA expression of ADAM17 in three human pancreatic cancer cellwere detected by using quantitative real-time PCR and Western blotting.The inducible lentiviral vectorsmediated short hairpin RNA（shRNA）interference targeting ADAM17 gene were constructed，and transfected it into pancreatic cancer cell line，then screened stably transfected clonal cell line.After different doxycline concentration to induce the expression of ADAM17-shRNA，cell proliferation and migration were analyzed by using the Cell Counting Kit-8（CCK-8）viability assay and scratch assay.Results：ADAM17 protein and mRNA were highly expressed in PANC1，SW1990 and Patu8988 human pancreatic cancer cells.After small interfering RNA（siRNA）to block the expression of ADAM17，the protein levels of ADAM17，cell proliferation and migration in the experiment group were significantly lower than that of control group（all P＜0.05）.Conclusion：ADAM17 protein and mRNA have been expressed highly in human pancreatic cancer cell and promotes the proliferation and migration of human pancreatic cancer cell.

a disintegrin andmetalloproteinase-17；TNF-αconverting enzyme；pancreatic cancer；proliferation；migration

R73-362

A

1671-7783（2015）04-0299-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140163

吳衡（1983—），男，江蘇宜興人，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤診治研究。

2014-05-30 ［編輯］陳海林