孔彪，沈冬麗，芮濤，張國(guó)輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

MicroRNA-195與Smad7靶向關(guān)系的研究

孔彪，沈冬麗，芮濤，張國(guó)輝

（江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇鎮(zhèn)江212002）

目的：構(gòu)建含有Smad7基因3′-UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體，利用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證MicroRNA195與其潛在靶基因Smad7的靶向關(guān)系。方法：PCR擴(kuò)增出Smad7基因3′-UTR區(qū)片段，以此構(gòu)建含3′-UTR的熒光素酶報(bào)告基因載體（wild type，WT）；將miRNA-195與熒光素酶報(bào)告重組子共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性；構(gòu)建含Smad7基因3′-UTR突變體（mutant，Mut）的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒，檢測(cè)熒光素酶活性變化。結(jié)果：測(cè)序結(jié)果表明，含有Smad7基因3′-UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建正確；熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照組相比，miRNA-195可使含Smad7基因3′-UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告重組子的熒光素酶活性降低40%左右；而定點(diǎn)突變Smad7基因3′-UTR的熒光素酶報(bào)告重組子熒光活性未有明顯變化。結(jié)論：成功構(gòu)建了Smad7基因3′-UTR區(qū)的熒光素酶報(bào)告基因載體，而miRNA-195可以直接作用于Smad7基因3′-UTR區(qū)，抑制其熒光素酶活性。

MicroRNA195；Smad7基因；熒光素酶報(bào)告基因；3′-UTR

微小RNA（miRNA）是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由18～24個(gè)核苷酸組成。它可與靶基因mRNA的3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，通過(guò)翻譯水平的抑制或斷裂靶標(biāo)mRNAs而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［1］。miRNA影響其目標(biāo)蛋白的生物學(xué)功能，對(duì)細(xì)胞增殖與分化進(jìn)行調(diào)節(jié)，并可加速細(xì)胞凋亡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病病理生理進(jìn)程的調(diào)控。國(guó)內(nèi)外大量基礎(chǔ)和臨床研究已證實(shí)，多種miRNA在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色［2-3］。van Rooij等［4］研究發(fā)現(xiàn)，心臟特異性的miRNA-195在哺乳動(dòng)物的肥大心肌中表達(dá)上調(diào)。目前尚未確定miRNA-195作用的靶基因，其介導(dǎo)心臟病變的機(jī)制也不明確。利用Target scan 5.1預(yù)測(cè)軟件，我們發(fā)現(xiàn)Smad7是miRNA-195的潛在靶基因之一，本研究旨在利用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者間的靶向關(guān)系，為進(jìn)一步研究心肌病心肌細(xì)胞肥大病理生理改變的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

胚腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞株、大腸埃希菌TOP10菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，miRNA mimics購(gòu)買于上海吉碼公司，轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD（Roche公司），經(jīng)改造的雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（pLUC載體）購(gòu)自華安平康公司，引物由Invitrogen公司合成。PCR試劑盒（TaKaRa公司），質(zhì)粒提取試劑盒（OMEGA公司），XhoⅠ、NotⅠ、T4DNA連接酶（Fermentas公司），雙熒光報(bào)告系統(tǒng)（Promega公司），細(xì)胞裂解液（Promega公司）。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建野生型和突變型Smad7熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒 Smad7基因3′-UTR序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，設(shè)計(jì)成對(duì)PCR擴(kuò)增引物。Smad7上游引物：5′-GTGGGGAGAAGAGGACAGGAC-3，下游引物：5′-GTGGTACCCACTTTCGCACA-3′。以基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得3′-UTR基因片段。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。將經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ酶切純化后的具有相同酶切位點(diǎn)的pLUC與3′-UTR PCR片段相連接，22℃連接2 h后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞TOP10，取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于LB平板上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。將經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒PCR鑒定正確的克隆菌液送測(cè)序，驗(yàn)證重組克隆插入片段的序列信息，含有目的序列的正確質(zhì)粒命名為（Luc-Smad7-WT）。定點(diǎn)突變?cè)揝mad7 3′-UTR中的核心序列（UGCUGCU），構(gòu)建含Smad7 3′-UTR突變體的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（Luc-Smad7-Mut）。

1.2.2 miRNA-195與Luc-Smad7-WT/Luc-Smad7-Mut共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 胰酶消化HEK293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，每1/96孔種2×104（100μL）細(xì)胞，將處理好的細(xì)胞均勻加于各孔中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h。每孔添加的試劑量：0.2μg Luc-Smad7-WT/Luc-Smad7-Mut，0.3μL Fugene HD，0.45μgmiRNA mimics，miRNA NC作為對(duì)照，一組實(shí)驗(yàn)3個(gè)復(fù)孔。30μL Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，最后加入0.9μL Fugene HD，混勻后室溫靜置15 min。將混合物取10μL均勻滴加于每孔細(xì)胞中，每3個(gè)孔為一實(shí)驗(yàn)組，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 熒光素酶活性檢測(cè) 轉(zhuǎn)染完成48 h后，采用Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行檢測(cè)。吸除轉(zhuǎn)染各孔內(nèi)的培養(yǎng)基，于各孔中加入80μL稀釋后的1×細(xì)胞裂解液，置于脫色搖床上振蕩1 h，收集各孔的細(xì)胞裂解液，12 000 r/min，離心1 min沉淀雜質(zhì)。取上述細(xì)胞裂解液于不透明96孔板各孔中，按照說(shuō)明書依次加入螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶底物，通過(guò)Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miRNA-195與Smad7基因3′-UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)

從Target scan 5.1預(yù)測(cè)軟件獲取miRNA-195與Smad7基因3′-UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，并以此構(gòu)建miRNA-195種子區(qū)突變體（種子區(qū)突變?yōu)橄嗷セパa(bǔ)的堿基），見(jiàn)圖1。

圖1 m iRNA195與Smad7靶位點(diǎn)配對(duì)示意圖

2.2 Smad7基因3′-UTR區(qū)的PCR擴(kuò)增

以基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得Smad7基因3′-UTR基因片段384 bp，DNA凝膠電泳結(jié)果顯示與預(yù)計(jì)大小相符（圖2）。

圖2 Smad7基因3′-UTR區(qū)的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

上述3′-UTR PCR片段純化后經(jīng)NotⅠ和XhoⅠ雙酶切處理，克隆到具有相同酶切位點(diǎn)的pLUC載體中，將經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行進(jìn)一步酶切鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒含有與Smad7基因3′-UTR基因片段大小相符合的插入片段（384 bp，圖3）。重組克隆插入片段經(jīng)測(cè)序鑒定證實(shí)為Smad7基因3′-UTR區(qū)（圖略）。

圖3 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建

2.4 miRNA-195對(duì)Smad7基因3′-UTR區(qū)的調(diào)控

結(jié)果表明，rno-miR-195與含Smad7基因3′-UTR片段的雙熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)相對(duì)于負(fù)對(duì)照（mimics NC與含Smad7基因3′-UTR片段的雙熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染）有極顯著性差異（t=13.291，P=0.006），同時(shí)熒光比值為負(fù)對(duì)照的56.30%。說(shuō)明rno-miR-195對(duì)Smad7 3′-UTR的基因表達(dá)水平有顯著抑制作用（圖4）。

rno-miR-195與含Smad7基因3′-UTR突變體片段的雙熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)相對(duì)于負(fù)對(duì)照（mimics NC與含Smad7基因3′-UTR突變體片段的雙熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.626，P=0.595），同時(shí)熒光比值為負(fù)對(duì)照的103.02%。說(shuō)明rno-miR-195對(duì)Smad7基因3′-UTR突變體的基因表達(dá)水平無(wú)抑制作用（圖4）。

圖4 m iRNA-195對(duì)Smad7基因3′-UTR的表達(dá)調(diào)控

3 討論

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的主要心臟并發(fā)癥之一，以心肌肥大和心肌纖維化為主要特征性病理改變，是導(dǎo)致糖尿病患者心血管系統(tǒng)疾病的高發(fā)生率和高病死率的重要原因，其發(fā)病機(jī)制、診斷治療已成為基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)，對(duì)心臟相關(guān)的miRNAs及多種病理?xiàng)l件下miRNAs差異性表達(dá)的研究，揭示了它在心血管疾病中重要的調(diào)節(jié)作用。miRNA-195參與了多種病因引起的心肌肥大的病理生理過(guò)程［3］。刁雪紅等［5］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-195在糖尿病小鼠模型的心肌組織中的表達(dá)明顯上調(diào)。而本課題組前期工作中同樣發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，miRNA-195表達(dá)也上調(diào)，因此推測(cè)miRNA-195在高糖引起的心肌細(xì)胞肥大中發(fā)揮重要作用，但其靶基因及其在糖尿病心肌病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚。

我們利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miRNA-195潛在靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-195種子序列可與Smad7的3′-UTR片段上的一段堿基序列完全配對(duì)。Smad7可通過(guò)阻斷TGF-β1受體與受體調(diào)節(jié)型Smad s或共同調(diào)節(jié)型Smads的結(jié)合抑制TGF-β1信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而阻斷TGF-β1的生物學(xué)效應(yīng)［6］。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織中Smad7表達(dá)減少，且其變化與糖尿病心臟病變相關(guān)，提示Smad信號(hào)系統(tǒng)失衡可能與糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)TGF-β1介導(dǎo)的心肌重構(gòu)可被Smad7阻斷，說(shuō)明以Smad7為代表的抑制型Smad s可發(fā)揮保護(hù)作用［7］。

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)作為一種重要的miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法，常被用來(lái)驗(yàn)證miRNA是否直接作用于其潛在靶基因的3′-UTR［8］。為了驗(yàn)證Smad7是否直接受miRNA-195的調(diào)控，我們將含有大鼠miRNA-195種子序列的Smad7的3′-UTR片段克隆到報(bào)告基因載體中，得到Luc-Smad7-WT報(bào)告載體，并且構(gòu)建了含有突變序列的載體Luc-Smad7-Mut。然后將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒和miRNA-195瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T工具細(xì)胞，利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)Luciferase熒光值。若能觀察到含有Smad7基因3′-UTR片段的外源性質(zhì)粒載體與miRNA-195寡核苷酸在工具細(xì)胞中相互作用，可認(rèn)為該作用機(jī)制具有普遍性［9］。結(jié)果顯示，在293T細(xì)胞中，野生型Smad7 3′-UTR+miRNA-195報(bào)告基因載體的熒光素酶活性較對(duì)照組顯著降低，而種子區(qū)突變體則無(wú)顯著差異。后期，課題組在高糖培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中通過(guò)轉(zhuǎn)染miRNA-195抑制劑，發(fā)現(xiàn)miRNA-195表達(dá)下調(diào)的同時(shí)，Smad7蛋白表達(dá)水平增加，推測(cè)miRNA-195通過(guò)TGF-β1/Smad通路參與糖尿病心肌病時(shí)的心肌肥大。上述結(jié)果充分證明Smad7確實(shí)為miRNA-195的靶基因。

綜上所述，miRNA-195可通過(guò)靶向抗心肌重構(gòu)基因Smad7，調(diào)控其表達(dá)水平，參與糖尿病心肌病心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本研究進(jìn)一步完善了糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制。在未來(lái)的臨床研究中，miRNA-195或許可作為糖尿病心肌病新的治療靶點(diǎn)。

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Investigating the relationship between M icroRNA-195 and Smad7

KONG Biao，SHEN Dong-li，RUITao，ZHANGGuo-hui
（Department of Cardiology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

Objective：The luciferase reporter vector containing 3′-UTR of Smad7 was constructed.Dual luciferase reporter gene system was applied to determine the association between miRNA-195 and its target gene Smad7.M ethods：The 3′-UTR of Smad7 fragment amplified by PCR was cloned into luciferase vector.MiRNA-195 and the luciferase reporters containing 3′-UTR（Smad7-3′UTR-WT）or mutant 3′-UTR（Smad7-3′UTR-Mut）of Smad7 were co-transfected into HEK293T cells and dual luciferase reporter gene system was applied to test luciferase activity.Results：DNA sequencing showed that the sequences of the cloned regions were correct.The luciferase activity of Smad7-3′UTR-WT plasmid treated with miRNA-195 was decreased to about 40%compared with control.Themutant3′-UTR were no longer repressed bymiRNA-195.Conclusion：The Smad7 3′-UTR luciferase reporter vector has been constructed successfully.MiRNA-195 can repress the luciferase activity of the reporter gene and had direct effect on Smad7 3′-UTR.

MicroRNA195；Smad7；luciferase reporter gene；3′-UTR

R393

A

1671-7783（2015）04-0286-04

10.13312/j.issn.1671-7783.150049

孔彪（1986—），男，碩士研究生；張國(guó)輝（通訊作者），博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail：13338812776@189.cn

2015-03-19 ［編輯］何承志