朱莉，許超艷，李晶晶，田俊，馮昭中，彭學(xué)

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生物合成對羥基苯甲酸的研究進展

朱莉，許超艷，李晶晶，田俊，馮昭中，彭學(xué)

江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇徐州 221116

朱莉, 許超艷, 李晶晶, 等. 生物合成對羥基苯甲酸的研究進展. 生物工程學(xué)報, 2015, 31(3): 328–337.Zhu L, Xu CY, Li JJ, et al. Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 328–337.

對羥基苯甲酸(4-Hydroxybenzoate，4HBA) 是用途廣泛的有機原料，現(xiàn)行的生產(chǎn)工藝是以石油成分合成而得，在環(huán)境污染不斷惡化、人類生存已經(jīng)面臨威脅之際，開發(fā)利用可再生資源的生產(chǎn)工藝已成為全球當(dāng)務(wù)之急。本綜述在簡要介紹從石油成分合成4HBA之后，主要闡述利用植物和微生物從可再生資源合成4HBA的研究進展。莽草酸途徑是生物合成芳香族化合物的重要途徑，從該途徑的最終產(chǎn)物分支酸到4HBA有兩條途徑。一條是分支酸裂解酶直接催化分支酸生成4HBA (莽草酸-分支酸路線)。另外一條途徑是在植物細胞內(nèi)引入熒光假單胞菌的對羥基肉桂酸-CoA裂解酶打通從苯丙素合成4HBA的通路 (植物苯丙素路線)。最后介紹了一個天然合成積累4HBA的微泡菌，并對其深入研究進行了展望。

對羥基苯甲酸，合成生物學(xué)，莽草酸途徑

對羥基苯甲酸 (4-Hydroxybenzoate，4HBA) 是用途廣泛的有機合成原料，主要應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥的防腐和防霉劑、殺菌劑的合成方面。2002年，我國4HBA的生產(chǎn)量為6 000 t，并以每年11.4%的速度遞增，預(yù)計2014年的生產(chǎn)量可達20 000 t以上[1]。4HBA的用途之一是4HBA酯類的合成，該酯類化合物的英文名為Paraben，其中甲酯又名為尼泊金甲，乙酯又名為尼泊金乙，是目前使用最多的防腐劑[2]。4HBA的另外一個重要用途是合成液晶高分子[3]。液晶是在1959年利用4HBA的乙酸酯經(jīng)熔融和固相聚縮合后首次獲得，后來經(jīng)過改良成具有實用價值的材料?，F(xiàn)在市場上的液晶商品“Xydar”是4HBA、對苯二酚和酞酸的聚合物；“X-7G”是4HBA和聚對苯二甲酸乙二酯在熔融狀態(tài)下的聚合物；“Vectra”是4HBA和2-羥基-6-萘甲酸熔融聚合物；“Tian”是4HBA和2-羥基-6-萘甲酸及對苯二酚的聚合物。

隨著電子信息化社會的不斷發(fā)展，4HBA的市場需求量日益增加，現(xiàn)行的4HBA生產(chǎn)工藝是從石油成分合成而得，在環(huán)境污染的不斷惡化、人類的生存已經(jīng)面臨威脅之際，利用可再生資源代替以石油為原料的生產(chǎn)工藝已成為全球當(dāng)務(wù)之急。4HBA的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于芳香族氨基酸，在理論上利用生物的芳香族氨基酸合成途徑，即莽草酸途徑(Shikimate pathway) 可以合成4HBA。這篇綜述首先介紹現(xiàn)行的4HBA化學(xué)合成工藝，然后著重闡述利用植物和微生物從可再生資源合成4HBA的實例，為生物合成4HBA提供理論依據(jù)。

1 從石油成分合成4HBA

1.1 化學(xué)合成

現(xiàn)行的4HBA生產(chǎn)工藝是以石油產(chǎn)物的苯(Benzene) 和丙烯(Propylene) 出發(fā)，在催化劑氯化鋁的存在下高溫高壓合成異丙苯(Cumene)，然后將異丙苯在80?130 ℃左右用氧氣氧化成過氧化氫異丙苯(Cumenehydroperoxide) (圖1A)。過氧化氫異丙苯在酸性和60?100 ℃條件下生成苯酚(Phenol)[4]。從苯酚到4HBA的制備有多種方法。常規(guī)工藝是利用Kolbe-Schmitt反應(yīng)，即將苯酚加入KOH制備成酚鉀鹽，然后與二氧化碳在高溫高壓下進行氣固相羧基化反應(yīng)生成4HBA。整個合成工藝必須在高溫高壓下進行，需要消耗大量能源導(dǎo)致生產(chǎn)效率低成本高。特別是合成途徑中有環(huán)境污染物質(zhì)苯酚的生成，給工業(yè)排水的處理帶來很大困難[5]。

1.2 生物轉(zhuǎn)化

白色生物技術(shù)(White biotechnology) 是近年來提出的新概念，即利用已知的代謝調(diào)節(jié)機理對各種微生物進行改造，構(gòu)建成一個“細胞工廠”，使其更好地服務(wù)于人類。甲苯(Toluene) 是石油中的一種沒有得到有效利用的芳香族成分，一些研究人員利用白色生物技術(shù)將惡臭假單胞菌DOT-T1E改造成一個從甲苯合成4HBA的細胞工廠[6-9](圖1B)。DOT-T1E菌株本來是甲苯降解菌株，且耐有機溶劑。DOT-T1E菌株降解甲苯的第一步驟是由甲苯雙加氧酶催化將甲苯氧化為-甲苯2,3-二氫二醇(-Toluene 2,3-dihydrodiol)，該酶由基因編碼?；蚓幋a的脫氫酶將-甲苯2,3-二氫二醇氧化成3-甲基苯二酚(3-Methylcatechol)，然后開環(huán)后進入三羧酸循環(huán)。

Ramos-González等[6]將編碼甲苯雙加氧酶基因中的基因敲除，同時將該菌株的基因也敲除掉構(gòu)建成一個甲苯營養(yǎng)缺陷型(DOT-??)，編碼的是4HBA-4-羥化酶，催化氧化4HBA成原兒茶酸(Protocatechuate) 的反應(yīng)。DOT-?C?成為不能降解甲苯和4HBA的菌株。在此遺傳背景下，負責(zé)轉(zhuǎn)化甲苯至4HBA的一系列基因從門多薩假單胞菌KR1菌株引入到該菌株的染色體中，構(gòu)建成DOT-T1E-24菌株。這一系列基因包括：，編碼甲苯單加氧酶，催化的反應(yīng)是在甲苯的4位引入一個羥基生成甲酚(-Cresol)；編碼甲酚單加氧酶，催化將甲酚氧化為4-羥基苯醇(4-Hydroxybenzyl alcohol) 和進一步氧化為 4-羥基苯醛(4-Hydroxybenzyl aldehyde) 的兩步反應(yīng)；編碼4-羥基苯醛脫氫酶，催化生成4HBA的反應(yīng)。在搖瓶分批培養(yǎng)條件下DOT-T1E-24菌株成功將甲苯轉(zhuǎn)化成4HBA，并得到12 mmol/L的積累記錄。從石油成分甲苯出發(fā)，理論上一個甲苯可以合成一個4HBA。

圖1 利用石油成分和可再生資源的4條4HBA合成途徑

2 利用植物的生物合成

2.1 利用莽草酸途徑的4HBA合成

莽草酸途徑由7步反應(yīng)合成分支酸(Chorismate)，是普遍存在于植物、真菌和細菌中的一條重要芳香族氨基酸合成代謝途徑。第一步是赤蘚糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸縮合成一個七碳酮糖開環(huán)磷酸化合物，3-脫氧-β-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)[10]。磷酸烯醇式丙酮酸和赤蘚糖4-磷酸分別是糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑上的重要中間代謝產(chǎn)物。分支酸是合成酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的分支點，從分支酸到4HBA的合成途徑有3條。

第一條是分支酸裂解酶(Chorismate lyase，UbiC) 直接催化分支酸生成4HBA (分支酸裂解酶途徑)[11-12](圖1C)。第二條是利用合成苯丙素(Phenylpropanoids) 的途徑(苯丙素途徑) (圖1D)。苯丙氨酸解氨酶催化脫掉芳香族氨基酸上的氨基生成相應(yīng)的苯丙素，然后和CoA鏈接成對羥基肉桂酸-CoA (4-Hydroxycinnamoyl-CoA)。對羥基肉桂酸-CoA裂解酶(4-Hydroxycinnamoyl-CoA lyase，HCHL)，催化對羥基肉桂酸-CoA的側(cè)鏈生成對羥基苯甲醛 (4-Hydroxybenzaldehyde)，然后該產(chǎn)物被氧化成4HBA[13]?；蛟谥参镏胁淮嬖?，從外源引入后能打通從苯丙素合成4HBA的通路。第三條在胡蘿卜中被發(fā)現(xiàn)，屬于對羥基肉桂酸-CoA非依賴途 徑[14-16]。苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶的催化下生成肉桂酸(Cinnamate)，肉桂酸羥化酶在4位引入一個羥基，生成對羥基肉桂酸，再通過非氧化途徑(Non-β-oxidative route) 合成4HBA。植物細胞是從CO2合成的，無論哪條途徑，其理論得率是4HBA/7CO2。

2.2 重組植物

利用重組煙草作為4HBA的生產(chǎn)宿主有兩個報道。一是Mayer等[17]在煙草的細胞質(zhì)內(nèi)表達熒光假單胞菌AN103的基因，使酪氨酸能夠生成4HBA。獲得的4HBA產(chǎn)量為煙草總量的2.9%，但是得到的4HBA都是葡糖基化產(chǎn)物，而且重組煙草的生長受到影響。二是杜邦公司的Viitanen等[18]和Sommer等[19-20]把大腸桿菌的基因轉(zhuǎn)化到煙草的葉綠體染色體上，并在其上游插入在葉綠體中特異轉(zhuǎn)錄的啟動子?；蛟跓煵莸娜~綠體內(nèi)表達成功，并合成了4HBA，產(chǎn)量為煙草總量的13%，但得到的4HBA也都是葡糖基化產(chǎn)物。

另外利用植物作為4HBA生產(chǎn)宿主的還有Rahman等[21]把基因重組到甜菜染色體中合成了葡糖基化和酯化4HBA，產(chǎn)量為甜菜總重的14%。Mitra等[22]把熒光假單胞菌AN103的基因重組到曼陀羅甜菜染色體中合成了葡糖基化和酯化4HBA，產(chǎn)量為曼陀羅甜菜總重的0.5%。McQualter等[23]向甘蔗內(nèi)分別導(dǎo)入了基因和基因，比較了4HBA的產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)基因重組株的產(chǎn)量高于基因重組株。從基因重組株的葉子里得到葡糖基化和酯化4HBA，產(chǎn)量為葉子總重的7.3%。利用0.1 mol/L的NaCl水解葡糖基化和酯化4HBA可以獲得4HBA。

利用光合作用的植物合成4HBA的最大優(yōu)點是直接利用二氧化碳，省去了繁瑣的木質(zhì)纖維素的糖化過程。但是植物細胞中含有葡糖基轉(zhuǎn)移酶，將4HBA葡糖基化或酯化，給下游提純工程帶來困難。另外利用胡蘿卜、甜菜和甘蔗等食物資源生產(chǎn)工業(yè)原料會造成糧食價格的上漲，給社會帶來不安定因素。

3 利用微生物的生物合成

3.1 大腸桿菌Escherichia coli

利用微生物生產(chǎn)4HBA的研究和植物相比比較少。美國密歇根州立大學(xué)的Frost教授課題組[24]對大腸桿菌進行了一系列的重組轉(zhuǎn)化，構(gòu)建了一株重組菌從葡萄糖生物合成了4HBA。在大腸桿菌中生物合成的4HBA沒有被糖基化或酯化。該課題組利用的菌株是D2704 []，合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的3個基因(、和) 均被敲除。因此培養(yǎng)D2704時必須在培養(yǎng)基中加入3種芳香族氨基酸。在D2704的染色體上引入了3個外源基因：一個是經(jīng)過誘變的DAHP合成酶基因aroF，其酶活性不受中間代謝產(chǎn)物的反饋抑制；二是分支酸裂解酶基因，負責(zé)將分支酸轉(zhuǎn)化成4HBA；三是轉(zhuǎn)酮醇酶基因，用來大量提供莽草酸途徑的中間體赤蘚糖4-磷酸。最后向該重組菌中轉(zhuǎn)化了一個在啟動子下高效表達一系列莽草酸途徑基因的質(zhì)粒，包括3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基轉(zhuǎn)移酶基因、莽草酸激酶基因、分支酸合成酶基因和3-脫氫奎尼酸基因。最終構(gòu)建的菌株名為JB161 [pJB2.274]。在實驗室規(guī)模上生產(chǎn)了12.0 g/L 4HBA (98.4 mmol/L)，對葡萄糖的收率為13%。另外Barker等[24]還調(diào)查了4HBA對大腸桿菌的毒性。實驗證明10 g/L的4HBA會抑制大腸桿菌的生長繁殖，同時抑制了莽草酸的中間體3-脫氫莽草酸的產(chǎn)量。以上實驗說明利用重組大腸桿菌生產(chǎn)的4HBA雖然沒有被糖基化或酯化，但是4HBA對大腸桿菌表現(xiàn)出了毒性，提高產(chǎn)量比較困難。另外培養(yǎng)基中需要添加芳香族氨基酸，使培養(yǎng)基的制備復(fù)雜化而且生產(chǎn)成本提高。

3.2 惡臭假單胞菌Pseudomonas putida

惡臭假單胞菌S12是一個耐有機溶劑菌株，Verhoef等[25-26]將其4HBA羥化酶(4HBA hydroxylase) 基因敲除后，轉(zhuǎn)化了一個載有苯丙氨酸解氨酶 (Phenyalanine ammonia lyase，Pal) 基因的質(zhì)粒，構(gòu)建成S12palB1菌株，該菌株失去了降解4HBA的能力。S12palB1菌株能將酪氨酸通過苯丙氨酸解氨酶轉(zhuǎn)化為對羥基肉桂酸，然后利用對羥基肉桂酸降解途徑合成4HBA。以葡萄糖為初始基質(zhì)在搖瓶中培養(yǎng)S12palB1菌株得到11% 4HBA/葡萄糖(Cmol%)。為了提高莽草酸途徑的前體赤蘚糖-4-磷酸的供應(yīng)，Meijnen等[27]將大腸桿菌的木糖降解基因引入到S12palB1菌株的染色體上構(gòu)建成S12xylB7菌株，使該菌株獲得了利用木糖的功能?；蚍謩e編碼木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶，催化木糖轉(zhuǎn)化為木酮糖-5-磷酸的反應(yīng)，構(gòu)建了從木糖到赤蘚糖-4-磷酸的途徑。在同時提供甘油和木糖的培養(yǎng)基中，合成出來的4HBA對基質(zhì)的收率為16.3% (Cmol%)。4HBA是從葡萄糖合成而得，如果葡萄糖的6個碳在發(fā)酵過程中沒有生成CO2釋放出去，全部用于4HBA的合成，那么碳的理論收率 (Cmol%) 應(yīng)該為100%，而質(zhì)量的理論收率() 為65.6%[28]。從這個數(shù)字來看，開發(fā)改造的潛力非常大。

3.3 釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae

Kr?mer等[29]將釀酒酵母的編碼分支酸變位酶(Chorismate mutase) 基因敲除掉構(gòu)建成菌株，因此該菌株是酪氨酸和苯丙氨酸的營養(yǎng)缺陷型。然后把載有大腸桿菌基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進菌株中構(gòu)建成pCV3-UBIC菌株。該菌株從83.3 mmol/L葡萄糖合成了650 μmol/L的4HBA，相當(dāng)于0.6% 4HBA/葡萄糖。產(chǎn)量不是很理想，這是由于大腸桿菌的基因的密碼子偏好性和釀酒酵母的差異很大，基因沒有得到有效表達。迄今為止沒有發(fā)現(xiàn)釀酒酵母的基因，今后只能通過人工改良大腸桿菌的基因來提高4HBA的產(chǎn)量。另外釀酒酵母也不存在對羥基肉桂酸降解途徑，從酪氨酸合成4HBA的難度很大。利用釀酒酵母作為4HBA合成宿主的最大優(yōu)點是糖利用效率高，而且高濃度的糖不抑制菌株的生長繁殖。

4 微泡菌Microbulbifer的次級代謝產(chǎn)物

4.1 微泡菌Microbulbifer

微泡菌又稱溶藻細菌，屬于變形菌綱，廣泛分布于海洋環(huán)境中，它生產(chǎn)的生理活性物質(zhì)以及海藻成分降解酶等越來越受到人們的重視[30-32]。2006年，本課題組首次發(fā)現(xiàn)從海洋環(huán)境中分離出的微泡菌菌株有合成4HBA和4HBA酯類的功能，在我們的調(diào)查范圍內(nèi)A4B-17菌株所合成的量最 多[33]。后來Quévrain等[34]在2009年也報道了他們分離的微泡菌菌株也合成了4HBA。合成積累4HBA和酯類是微泡菌的一個特征。4HBA是芳香族高分子木質(zhì)素的降解產(chǎn)物，在土壤環(huán)境中很多微生物擁有降解4HBA基因，4HBA不會在體內(nèi)外積累[35-37]。微泡菌是在海洋環(huán)境中生存的微生物，表現(xiàn)出和土壤環(huán)境不同的面目，不但不降解而且還合成積累4HBA。

4.2 微泡菌sp. A4B-17菌株

微泡菌sp. A4B-17菌株在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時有合成積累4HBA和其酯化物的功能，當(dāng)細胞進入穩(wěn)定期后在培養(yǎng)基里積累了10 mg/L的4HBA和各種酯化物，總量約30 mg/L。雖然4HBA的量不是很高，但是野生菌株合成積累4HBA的能力是首次發(fā)現(xiàn)。如果適當(dāng)發(fā)揮其天然潛力，對A4B-17菌株的4HBA合成基因進行改造，有希望合成更多的4HBA，以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。

4HBA和相應(yīng)醇類酯化后的產(chǎn)物叫4HBA酯類 (Parabens)。1920年，人工合成并發(fā)現(xiàn)4HBA酯類有抑菌作用后，由于4HBA酯類具有價格便宜、無色、無毒、較為廣泛的抑菌譜且抑菌作用不受pH影響等特點，現(xiàn)在作為防腐劑廣泛應(yīng)用于食品和化妝品的保存方面[38-40]。以前認為4HBA酯類是人工化合物，我們的發(fā)現(xiàn)闡明微泡菌早已經(jīng)把它們當(dāng)作抑菌劑，遏制周圍微生物的生長繁殖擴大自己的生存空間。通過A4B-17菌株的次級代謝產(chǎn)物的研究也會使我們了解海洋環(huán)境中微生物與微生物之間的拮抗作用。研究還發(fā)現(xiàn)，A4B-17菌株的次級代謝產(chǎn)物中含有4HBA丁酯、4HBA壬酯和4HBA庚酯，而且是按照梯度“4HBA丁酯>4HBA壬酯>4HBA庚酯”合成出來的。而這個梯度具有生理意義，是有效抑制微生物生長的合理梯度。是什么調(diào)控機制使A4B-17菌株按照這個梯度合成4HBA酯類，這個梯度是否受到環(huán)境因素的影響？這些問題將在今后的研究中闡明。

本課題組完成了A4B-17菌株的基因組測序和注釋工作。A4B-17菌株不含有質(zhì)粒，只有一個染色體，全長為5 040 512 bp，共預(yù)測出4 766個基因。A4B-17菌株有3條葡萄糖降解途徑 (糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和Entner-Doudoroff (ED) 途徑)。而且還預(yù)測出一些酶催化連接這3條途徑的反應(yīng)，因此從葡萄糖至烯醇式丙酮酸和赤蘚糖-4-磷酸的途徑非常通暢。

5 展望

利用植物合成4HBA的缺點是4HBA在植物中是以葡糖基化或酯化產(chǎn)物的形式存在，給下游提純工程帶來困難，特別是苯丙素(Phenylpropanoids) 合成途徑中的一些步驟尚不明了。利用細菌作為合成4HBA的細胞工廠有以下優(yōu)點：1) 細菌的生長繁殖速度快，代謝周期短；2) 4HBA的合成可以部分利用細菌的芳香族氨基酸的合成途徑；3) 4HBA對細菌的毒性較小，可以高濃度積累生產(chǎn)；4) 沒有對環(huán)境和人類有害的中間產(chǎn)物生成；5) 在中國，苯、甲苯和葡萄糖的價格分別為每噸6 200、9 800和2 900元，而4HBA的價格為25 000元/t[41]。雖然從苯和甲苯出發(fā)理論上可以獲得100%的4HBA收率，而葡萄糖轉(zhuǎn)化為4HBA的理論收率也為65.6% (/)，葡萄糖的價格相對較低，經(jīng)過計算理論上可以獲得4 421元/t的4HBA。無論從環(huán)境角度還是經(jīng)濟角度利用微生物從可再生資源的葡萄糖合成4HBA，理論上要優(yōu)于其他方法。

目前雖然利用重組微生物合成4HBA有一定的研究進展，但是這些微生物都是本身不合成積累4HBA的菌株，通過復(fù)雜的改造代謝途徑和反饋調(diào)控機制會給4HBA的高效生產(chǎn)帶來局限性。本課題組擬采取以下策略研究開發(fā)A4B-17菌株。1) 合成基因研究。通過基因敲除、表達譜分析等手段驗證4HBA合成途徑中的關(guān)鍵基因功能，如葡萄糖轉(zhuǎn)運和磷酸化基因、赤蘚糖-4-磷酸的合成基因、DAHP合成酶基因和分支酸裂解酶基因。2) 闡明關(guān)鍵部位的調(diào)控機制。4HBA和酯類都屬于次級代謝產(chǎn)物，它們的合成必將受到各種因素的影響。我們假設(shè)3種因素 (內(nèi)在因素、物化因素和抑制對象) 對代謝途徑上的3個作用位點(PEP位點、4-磷酸赤蘚糖位點、分支酸位點) 有一定影響。PEP位點包括PEP激酶和DAHP合成酶；4-磷酸赤蘚糖位點包括轉(zhuǎn)酮酶和DAHP合成酶；分支酸位點包括分支酸裂解酶、鄰氨基苯甲酸合成酶 (Anthranilate synthase) 和分支酸變位酶。本課題組將利用天然合成積累4HBA的A4B-17菌株作為宿主，在深入研究代謝途徑和調(diào)控機制的基礎(chǔ)上開發(fā)合成4HBA的工業(yè)微生物。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Recent advances in biosynthesis of 4-hydroxybenzaote

Li Zhu, Chaoyan Xu, Jingjing Li, Jun Tian, Zhaozhong Feng, and Xue Peng

,,221116,,

4-Hydroxybenzoate (4HBA) is an important chemical compound used for synthesis of liquid crystal. Production of 4HBA from renewable resources is an effective mean to solve problems such as environmental pollution and petroleum shortage. This review briefly introduces the chemical synthesis of 4HBA from oil compounds, and mainly describes the progress in 4HBA biosynthesis from renewable resources by plants and microorganisms. In most intriguing aspect of plant-based synthesis of 4HBA is the appeal of directly synthesizing a chemical from CO2. However, the glucosylation system in plant cells converting 4HBA to glucose conjugates, causing the post treatment a problem. The recombinant microorganisms produce pure 4HBA, but less efficient. A new strain ofhas ability to naturally accumulate 4HBA from glucose. Elucidation of the metabolic pathways and regulation systems would improve 4HBA synthesis efficiency.

4?hydroxybenzoate, synthetic biology, shikimate pathway

May 28, 2014; Accepted:October 15, 2014

Xue Peng. Tel/Fax: +86-516-83500033; E-mail: pengxue@jsnu.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31240088), Science and Technology Project of Xuzhou (No. XM12B105), Jiangsu Science and Technology Agency Project (No. BK20141148).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31240088)，徐州市科技項目(No. XM12B105)，江蘇科技廳項目 (No. BK20141148) 資助。

2014-12-03

http://www.cnki.net/kcms/doi/10.13345/j.cjb.140300.html