張陽璞，楊淑慎

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幾種新型植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法

張陽璞，楊淑慎

西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌 712100

張陽璞, 楊淑慎. 幾種新型植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(3): 311–327.Zhang YP, Yang SS. Methods for construction of transgenic plant expression vector: a review. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 311–327.

利用基因工程技術(shù)手段研究基因功能過程中，構(gòu)建基因表達(dá)載體處于轉(zhuǎn)基因植物的主導(dǎo)地位，采用合適的構(gòu)建方法會(huì)使實(shí)驗(yàn)效果事半功倍。植物基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法除了傳統(tǒng)構(gòu)建法、Gateway技術(shù)、三段T-DNA法、一步克隆法等，還有近年來出現(xiàn)的幾種新型的載體構(gòu)建方法：基于競爭性連接原理快速構(gòu)建小片段基因表達(dá)載體；MicroRNA前體PCR置換法適用于構(gòu)建小分子RNA表達(dá)載體；重組融合PCR法特別適用于插入片段中含有較多限制性酶切位點(diǎn)的載體構(gòu)建；利用In-Fusion試劑盒可以將任何目的片段插入一個(gè)線性化載體的某個(gè)區(qū)域；構(gòu)建多片段復(fù)雜載體可采用不依賴序列和連接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson等溫拼接法；Golden Gate拼接法。本文將在總結(jié)分析前人工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合自己工作的體會(huì)和經(jīng)驗(yàn)分析這7種新方法的特點(diǎn)，期望通過這幾種新的方法給植物基因工程表達(dá)載體的構(gòu)建提供新的思路。

MicroRNA前體PCR置換法，In-Fusion試劑盒法，重組融合PCR法，Gibson等溫拼接法，Golden Gate拼接法

基因克隆、載體構(gòu)建是植物功能基因組研究中的常規(guī)步驟[1]。而載體構(gòu)建是基因工程和分子生物學(xué)研究中常用的基礎(chǔ)技術(shù)。隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，適合于不同研究目的各種載體系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，其中在轉(zhuǎn)基因植物中最常用的是質(zhì)粒載體[2]。傳統(tǒng)的載體構(gòu)建方法在進(jìn)行構(gòu)建多片段拼接的復(fù)雜載體時(shí)，需要精心選擇酶切位點(diǎn)，有時(shí)還需要構(gòu)建多個(gè)中間載體，操作比較麻煩，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此尋找簡單、高效、快捷的載體構(gòu)建方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。從1969年Arber等[3]發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶，載體的構(gòu)建方法逐步發(fā)展，從傳統(tǒng)構(gòu)建方法到三段T-DNA、Gateway等技術(shù)延伸出了許多新的載體構(gòu)建方法。本文結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)工作選擇介紹了近年來其中幾種新型的具有代表性的植物表達(dá)載體構(gòu)建的方法，對其應(yīng)用的方向、優(yōu)缺點(diǎn)作出了評估，期望給植物基因工程表達(dá)載體的構(gòu)建提供新的思路。

1 載體構(gòu)建方法

1.1 快速構(gòu)建小片段基因表達(dá)載體

基因產(chǎn)物克隆的方法有很多種，如共環(huán)消解法、T4 DNA聚合酶回切產(chǎn)生粘端、外切核酸酶Ⅲ回切產(chǎn)生粘末端、PCR產(chǎn)物非依賴連接克隆、TA克隆等，這些方法原理不一，應(yīng)用的方向也不相同，但都不適合小片段基因的克隆及其載體的構(gòu)建[4]。傳統(tǒng)構(gòu)建方法構(gòu)建載體時(shí)需要PCR擴(kuò)增，用2個(gè)不同的限制性內(nèi)切酶酶切PCR產(chǎn)物和載體，酶切后進(jìn)行膠回收等，步驟繁瑣、連接成功率低，任何一個(gè)步驟出現(xiàn)問題都會(huì)導(dǎo)致最終實(shí)驗(yàn)失敗。因此，提高酶切和連接的效率是提高實(shí)驗(yàn)成功率的關(guān)鍵。

通常在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)中我們會(huì)將酶切后的片段進(jìn)行回收濃縮，而且使用較小的連接體系，這種方法就利用了競爭性連接的特點(diǎn)，來源于化學(xué)中的有效碰撞原理，連接反應(yīng)也是一個(gè)化學(xué)反應(yīng)，當(dāng)在進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)分子數(shù)目多的目的片段分子更加容易與載體分子接觸，換言之，有效分子濃度更高，則更容易發(fā)生連接反應(yīng)，同時(shí)能有效減少載體自連反應(yīng)。

小片段基因載體構(gòu)建時(shí)，小片段的PCR技術(shù)又比較困難，尤其是在酶切回收步驟，也常出現(xiàn)酶切后的粘性末端被降解的現(xiàn)象[4]，因此需要采取辦法避免這些常見問題。金磊等[4]提出的新方法是基于小片段基因寡聚核苷酸合成技術(shù)和競爭性連接原理。利用寡聚核苷酸合成的方法，省去了目的基因的酶切步驟和載體酶切后膠回收純化步驟，解決了小片段PCR困難的問題；利用競爭性連接原理可以克服載體自連，同時(shí)提高連接效率。其應(yīng)用該方法已經(jīng)完成了4個(gè)小片段基因(67 bp) 表達(dá)載體的構(gòu)建，連接成功率達(dá)到66.7%?100%。證明了該方法具有簡單快速、節(jié)省試劑費(fèi)用和連接效率高等特點(diǎn) (具體流程見圖1A)。

圖1 小片段競爭性連接示意圖(A)和兩種方法的差異對比圖(B)

雖然寡核苷酸可以通過化學(xué)方法合成[5-7]，但是當(dāng)寡核苷酸的長度超過100 nt (核苷酸) 時(shí)，隨著長度的增加化學(xué)合成的質(zhì)量急劇下降，而且成本會(huì)上升，也會(huì)增加回收純化的難度[8-9]，因此此方法在構(gòu)建100 nt以上寡核苷酸片段時(shí)有一定的局限性。如何增加合成的寡核苷酸的長度也將成為此方法推廣的關(guān)鍵所在。

在目的片段較長時(shí)也能利用到競爭性連接原理提高載體構(gòu)建效率。筆者曾根據(jù)此原理成功構(gòu)建了pTCK303-GAPDH (Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶) 表達(dá)載體，根據(jù)單克隆菌落的數(shù)目和陽性菌落的數(shù)目對比 (圖1B)，反映了在轉(zhuǎn)化的菌落數(shù)目上和陽性克隆的比率上有所提高。通常構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，目的基因的長度一般比較大，根據(jù)上述方法的原理，同樣可以通過增加酶切后目的基因片段的濃度來減少載體的自連反應(yīng)，增加連接反應(yīng)的效率。實(shí)驗(yàn)過程中增加酶切后目的基因濃度的方法有很多種，比如：擴(kuò)增目的基因后使用DNA純化回收試劑盒回收目的片段或者平行多次擴(kuò)增目的基因后一起進(jìn)行回收然后酶切等。

1.2 MicroRNA前體PCR置換法

自1999年Hamilton等[10]首次發(fā)現(xiàn)了長度為25 nt的RNA中間產(chǎn)物后，RNAi技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物基因功能鑒定和功能基因表達(dá)調(diào)控等各個(gè)領(lǐng)域。前人的研究中構(gòu)建RNAi載體的方法主要有：傳統(tǒng)的酶切連接法、Gateway技術(shù)、重疊延伸PCR法、LIC克隆法和Golden Gate克隆法[11]。

重疊延伸PCR技術(shù)(Gene splicing by overlap extension PCR，簡稱SOEPCR)，于1989年由Horton等[12-13]建立，主要方法是采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴(kuò)增片段重疊拼接起來。此技術(shù)利用PCR技術(shù)能夠在體外進(jìn)行有效的基因重組，而且不需要內(nèi)切酶消化和連接酶處理，用這一技術(shù)可以很快獲得其他依靠限制性內(nèi)切酶消化的方法難以得到的產(chǎn)物[14]，如Cao等[15]利用寡聚核苷酸合成技術(shù)和重疊延伸PCR技術(shù)合成了布氏檸檬酸桿菌植酸酶基因，并檢測了其高效的表達(dá)。應(yīng)用此方法還可以對目的基因進(jìn)行小泛素相關(guān)基因的修飾，如Lu等[16-17]利用這種方法對HV1蛋白進(jìn)行了泛素化修飾從而解決了此蛋白在大腸桿菌內(nèi)外源表達(dá)易被降解的問題，以及泛素化修飾鴿子B淋巴細(xì)胞刺激因子() 增強(qiáng)了其在大腸桿菌內(nèi)的可溶性表達(dá)。但是需要指出的是重疊延伸PCR技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中，經(jīng)常會(huì)受到引物自身序列的限制，例如，引物同 (異) 二聚體的產(chǎn)生導(dǎo)致的擴(kuò)增效率低下，擴(kuò)增片段中的重復(fù)序列導(dǎo)致產(chǎn)物突變等諸多問題[18]。

陳銳等[19]在研究中以成功構(gòu)建攜帶預(yù)設(shè)小分子RNA的人工miRNA前體(Artificial pre- miRNA，apmiRNA) gso8-ap-miRNA為例介紹了一種新型的小分子RNA表達(dá)載體構(gòu)建方法。此新方法利用了miRNA的單鏈前體(Pre-miRNAs) 具備特征性的發(fā)卡環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)，再利用分段重疊延伸PCR法置換成熟鏈及星號(hào)鏈為目的片段 (圖2)。該方法為小分子RNA的功能研究提供了便捷有效的途徑。

圖2 置換PCR示意圖[19]

筆者在構(gòu)建基因的干擾載體時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然選取了需要沉默的基因中的部分片段作為構(gòu)建干擾載體的目的基因，但是這些植物本身的基因并不含有特定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這樣依照此法構(gòu)建人工miRNA前體時(shí)，可能不能更有效地表達(dá)外源小分子RNA。另外，此種方法理論基礎(chǔ)是內(nèi)源的miRNA成熟加工機(jī)制，但是目前一些miRNA代謝通路上的生成機(jī)制尚不清楚，這些都使得此方法在應(yīng)用上具有一定的局限性[19]。在構(gòu)建不含有特異的miRNA作為骨架的干擾載體時(shí)，可以使用In-Fusion試劑盒法將小干擾片段插入到載體的任意位置。

1.3 重組融合PCR法

基因的同源重組是噬菌體、細(xì)菌到真核生物都普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象[20]。廣義的同源重組是指含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合[21-23]，同源重組嚴(yán)格依賴DNA分子之間的同源性，因此，原核生物的同源重組通常發(fā)生在DNA復(fù)制的過程中，而真核生物的同源重組則常見于細(xì)胞周期的S期之后，DNA的修復(fù)過程中也會(huì)發(fā)生同源重組的現(xiàn)象[24]。以同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建突變或缺失的同源媒介基因載體并取代基因組中野生型的等位基因，進(jìn)而研究目的基因與表型性狀間的關(guān)系，是研究動(dòng)物、植物、微生物基因功能的一種非常有用的遺傳操作方法[25-26]。

常用的同源重組克隆的策略包括：T4 DNA聚合酶介導(dǎo)的同源重組，ExonucleaseⅢ介導(dǎo)的同源重組，RF克隆等[18]。這些傳統(tǒng)構(gòu)建方法由于要避免目的片段中已有限制性酶切位點(diǎn)，而不得不選擇構(gòu)建中間載體或者選擇昂貴且酶切效率低的非常用限制性酶，經(jīng)過多次連接轉(zhuǎn)化，操作麻煩，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不但大量增加了載體構(gòu)建的工作量，而且實(shí)驗(yàn)成功得不到保證。融合PCR技術(shù)在不經(jīng)過酶切和連接的條件下，采用具有互補(bǔ)末端的引物將不同來源的擴(kuò)增片段連接起來，為同源重組片段的構(gòu)建提供了快速簡捷的途徑[27-28]?，F(xiàn)有的融合PCR技術(shù)一般包括兩步PCR反應(yīng)，類似于重疊延伸PCR法[12-13]和一步克隆法[30]：1) 分別設(shè)計(jì)5′端帶有互補(bǔ)序列的若干條特異性引物，分別進(jìn)行各個(gè)片段的擴(kuò)增；2) 隨后在同體系加入各片段，以一對外側(cè)引物進(jìn)行融合片段的全長序列的擴(kuò)增。

鄺翡婷等[31]以水稻胚乳特異性熒光表達(dá)載體PGt1-mGFP-pSB130為例，介紹一種結(jié)合同源重組和融合PCR兩種方法的重組融合PCR構(gòu)建載體方法(圖4)，重組融合PCR法主要有以下優(yōu)勢：1) 只要求骨架載體上有一個(gè)特異性酶切位點(diǎn)，特別適用于插入片段中含有較多限制性酶切位點(diǎn)的載體構(gòu)建；2) 可以引入定點(diǎn)突變，可便捷構(gòu)建分析啟動(dòng)子功能等需引入定點(diǎn)突變的載體[32]；3) 實(shí)現(xiàn)多基因的無縫融合構(gòu)建多順反子，在構(gòu)建原核基因表達(dá)載體、葉綠體表達(dá)載體、線粒體表達(dá)載體方面有著明顯優(yōu)勢[31]。

以此方法構(gòu)建帶有標(biāo)記基因的表達(dá)載體，可以檢測目的基因的表達(dá)或者進(jìn)行亞細(xì)胞定位，利用該方法可將目的基因與標(biāo)記基因利用單個(gè)酶切位點(diǎn)一步克隆連接到目的載體上。總之，重組融合PCR法可以將不同來源的幾個(gè)目的片段僅通過一次重組轉(zhuǎn)化克隆到目的載體上，大量減少中間載體的構(gòu)建，提高工作效率和實(shí)驗(yàn)成功率。但是在應(yīng)用過程中還存在很多方面的問題，如融合產(chǎn)物長度一般在40 kb以下、待融合片段的個(gè)數(shù)一般不超過3個(gè)、產(chǎn)物特異性差等[27]，這也給其廣泛應(yīng)用帶來了一定的限制。

1.4 In-Fusion試劑盒法

構(gòu)建載體時(shí)需要通過連接酶連接完成，而且選擇酶切位點(diǎn)時(shí)通常會(huì)被載體上獨(dú)特的酶切位點(diǎn)所限制[33]，因此能夠擺脫酶切位點(diǎn)的限制，省略酶切與連接的步驟，并且能夠在載體的任意位置上插入目的基因的序列是載體構(gòu)建發(fā)展的新趨勢。Gateway技術(shù)、一步克隆法等技術(shù)的出現(xiàn)大大簡化了載體構(gòu)建的步驟，但仍然沒有解決酶切位點(diǎn)的限制等問題。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，利用In-Fusion試劑盒(In-FusionTMadvantage PCR cloning kit) 能夠擺脫酶切位點(diǎn)的限制，利用這種方法可以對任何常用的載體進(jìn)行修飾，用單酶切或者利用PCR擴(kuò)增的方法將載體線性化，使之成為一個(gè)不依賴序列和連接反應(yīng)高效的基因克隆體系[34]，該方法利用重疊PCR技術(shù)在PCR引物的5'端增加一個(gè)與線性載體兩端同源的15 bp的序列，由于序列的同源性，通過PCR程序可將目的基因插入到載體中，實(shí)現(xiàn)DNA重組[35-36]。這種方法操作簡單，對目的基因和載體沒有特殊的要求，可以將任何目的片段插入一個(gè)線性化載體的某個(gè)區(qū)域，不會(huì)產(chǎn)生反向插入的問題，沒有知識(shí)產(chǎn)權(quán)限制[36-37]，而且適用于在多宿主中的表達(dá)[34]。

利用In-Fusion試劑盒構(gòu)建表達(dá)載體的基本原理與步驟 (圖3A)。1) 質(zhì)粒的線性化(單酶切或雙酶切)；2) 目的基因的In-Fusion改造；3) 經(jīng)過In-Fusion改造目的基因片段與線性載體在In-Fusion酶的作用下發(fā)生重組，使目的基因連接到載體上；4) In-Fusion產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與檢測；5) 提取陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證[40]。

劉超等[38]利用In-Fusion技術(shù)成功將基因亞克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pCMV- IRES-DsRed上得到pCMV-SCN1A-IRES-DsRed表達(dá)載體；林朝貴等[39]以此方法成功構(gòu)建了p-GCFU-Survivin慢病毒表達(dá)載體；韓凱等[40]以此方法成功構(gòu)建了玉米L谷氨酰胺合成酶基因 () 表達(dá)載體pCUbi1390-Ubi- GS1-35S-EPSPS，證明了其簡單、高效、快速、無需酶切連接和能夠無限制、不定點(diǎn)插入的 特點(diǎn)。

In-Fusion法與重組融合PCR法的不同點(diǎn)在于In-Fusion法可以根據(jù)質(zhì)粒上的任意酶切位點(diǎn)將目的片段分多次插入 (圖3B)，而重組融合PCR法是將不同來源片段通過融合之后一步克隆到載體上，因此利用In-Fusion的方法更加有利于構(gòu)建插入多個(gè)小片段的干擾載體，而重組融合PCR法更加適用于構(gòu)建需要添加標(biāo)記基因的載體。利用In-Fusion試劑盒法可以減少連接、轉(zhuǎn)化的次數(shù)，且重組效率高。相對于Gateway技術(shù)來說，In-Fusion法更簡單、更快速，只要設(shè)計(jì)特殊的In-Fusion引物擴(kuò)增目的片段， 30 min就可以轉(zhuǎn)化，將目的基因高效地轉(zhuǎn)入載體中，廣泛適用于各種表達(dá)載體的構(gòu)建[40]。但是，在一些轉(zhuǎn)基因植物研究中需要構(gòu)建由Ti質(zhì)粒衍生而來的雙元載體來提高轉(zhuǎn)基因的效率。雙元載體普遍較大，不適合使用PCR擴(kuò)增的方法將其線性化，這也是此方法的一個(gè)限制性因素。Berrow等[34]利用這一技術(shù)進(jìn)行高通量載體構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)克隆效率超過90%，明顯高于Gateway重組技術(shù)(79%) 和傳統(tǒng)的限制性酶切連接技術(shù)(87%)[41]。

圖3 重組融合PCR示意圖

圖4 In-Fusion試劑盒構(gòu)建表達(dá)載體的步驟

1.5 SLIC法

在一些基因共表達(dá)的研究中，需要構(gòu)建一些大型復(fù)雜載體，將若干個(gè)目的片段依次、連續(xù)連接到目標(biāo)載體上，插入片段較多，酶切位點(diǎn)難以選擇，通常的構(gòu)建方法是使用平末端連接，但是平末端連接效率低且工作量與難度 較大。

Li和Elledge所建立的不依賴序列和連接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning，SLIC)[42]，把同源重組與單鏈退火結(jié)合起來，可以高效、定向地將任意序列的2個(gè)[43]或2個(gè)以上的DNA片段組裝到一起，不需要連接反應(yīng)即可完成體外的重組，避免目的基因序列中原有酶切位點(diǎn)對DNA重組的限制，極大地簡化了DNA重組過程[44]。

采用SLIC法構(gòu)建復(fù)雜載體的基本步驟 (圖5)：1) 采用PCR擴(kuò)增使載體線性化；2) 在PCR的引物兩端加上與載體末端同源的DNA序列 (20?30 bp)，擴(kuò)增目的基因；3) 用T4 DNA聚合酶處理目的基因和載體片段，使其5'末端形成突出單鏈；4) 在T4 DNA連接酶緩沖體系中退火，形成重組中間體；5) 轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選重組子[45]。

白帆等[45]在研究中證明了SLIC的重組是非?？煽康?，能夠在設(shè)計(jì)位點(diǎn)處發(fā)生精確重組。王廣珺等[46]對此種方法進(jìn)行了改進(jìn)，將T4 DNA連接酶緩沖液改換成退火緩沖液，并使用相應(yīng)的退火程序，可使重組效率提高至少10倍。Jeong等[47]對此方法進(jìn)行了簡化，稱為一步SLIC (One-step SLIC)，其改進(jìn)是直接將擴(kuò)增得到的目的基因與線性化載體混合后在室溫下用T4 DNA聚合酶處理2.5 min，冰上孵育10 min直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并成功完成了4個(gè)片段的拼接。

圖5 SLIC法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟

采用SLIC法構(gòu)建載體時(shí)，目的基因在2–8個(gè)之間效果較好，目的基因片段越多，篩選得到正確的重組子越困難，效率越低。在不超過5個(gè)基因片段連接的情況下，可以保證轉(zhuǎn)化子100%為重組子，在10個(gè)基因片段連接的情況下，16%的轉(zhuǎn)化子為正確的重組子[45]。值得注意的是，經(jīng)過T4 DNA聚合酶處理后形成的ssDNA非常容易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而影響DNA分子的互補(bǔ)、復(fù)性并降低重組效率[46]。另外，由于SLIC依賴于同源重組進(jìn)行基因克隆，同源重組本身具有一定的隨機(jī)性，因此可能產(chǎn)生不完整的重組子[43]。

1.6 Gibson等溫拼接法

Gibson等溫拼接法是Gibson等[48]報(bào)道的一種高效、快速的多基因片段拼接技術(shù)，由Gibson變溫拼接法發(fā)展而來。與SLIC法相似，可以將任意序列的2個(gè)或2個(gè)以上的DNA片段組裝到一起，適用于復(fù)雜載體的構(gòu)建。不同的是，通過控制目的片段重疊序列的大小 (40?600 bp) 可以直接在體外合成得到較大的基因組序 列[49]，大大簡化了大型DNA分子合成的過程，展示了其廣泛的應(yīng)用前景。

采用Gibson法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟 (圖6)：1) 用兩端帶有與載體末端同源序列的引物PCR擴(kuò)增目的基因；2) 將PCR產(chǎn)物加入3種酶 (Phusion或聚合酶、T5外切酶和DNA連接酶)[47-48]的混合緩沖液中；3) 混合液在50 ℃恒溫孵育一段時(shí)間，時(shí)間由片段長短確定。高保真的DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶的活性，擴(kuò)增過程中可以將錯(cuò)配的堿基切掉，保證其準(zhǔn)確性。除去擴(kuò)增目的基因和載體片段的步驟，只需要一步等溫反應(yīng)就能完成片段的拼接，因此這一部分被Gibson命名為一步體外等溫重組法 (One-step isothermalrecombination)[48]。

Sleight等[50]采用Gibson法成功組裝了CMY (Cyan-Magenta-Yellow，青色-洋紅色-黃色) 三基因表達(dá)載體，并且通過插入不同的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止子，使得CFP、RFP和YFP三種熒光蛋白能夠在外界環(huán)境調(diào)控下獨(dú)立隨機(jī)表達(dá)；Bartosiak-Jentys等[51]也用此種方法成功構(gòu)建了由4片段基因組成的大腸桿菌-地芽胞桿菌sp.穿梭載體pUCG3.8，并發(fā)現(xiàn)其相對于原始的穿梭載體pUCG18轉(zhuǎn)化熱葡糖苷酶地芽胞桿菌的效率增加了2.8×105CFU/(μg DNA)；Wagner等[52]使用Gibson法和傳統(tǒng)的酶切-連接法都成功構(gòu)建了惡性瘧原蟲載體，并證明Gibson法的效率明顯高于傳統(tǒng)的酶切-連接法。Gibson等成功在體外組裝了多達(dá)583 kb的尿道支原體基因組序列[48]以及16.3 kb的鼠線粒體基因組序列[53]，為基因組學(xué)的研究提供了新途徑。

此種方法所用的3種酶均為實(shí)驗(yàn)室常見的3種酶，一步組裝，簡便、快速。在實(shí)際的操作中，核酸外切酶可能水解掉較短片段，因此此種方法不適合用于小片段基因的組裝。Stefan等[54]在研究中發(fā)現(xiàn)在2個(gè)基因片段連接的情況下，可以保證轉(zhuǎn)化子80%為正確的重組子，隨著基因片段數(shù)目的增加，在8個(gè)基因片段連接的情況下，13%的轉(zhuǎn)化子為正確的重組子，其效率比SLIC法略低。

圖6 Gibson等溫拼接法構(gòu)建表達(dá)載體的步驟

1.7 Golden Gate拼接法

在使用SLIC、Gibson法構(gòu)建多片段復(fù)雜載體時(shí)，基因片段末端的ssDNA同源序列不能包含單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)，且片段末端ssDNA同源序列應(yīng)各不相同，否則會(huì)導(dǎo)致重組效率降低、片段的丟失和錯(cuò)排等現(xiàn)象。傳統(tǒng)的Golden Gate克隆法構(gòu)建復(fù)雜載體時(shí)不需要進(jìn)行額外的PCR擴(kuò)增和載體線性化的步驟，直接使用未經(jīng)酶切的含有目的基因的載體在一個(gè)反應(yīng)中完成多個(gè)序列的組裝 (圖7X)[55-58]，可以對擁有重復(fù)的復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)的激活子進(jìn)行拼接，如效應(yīng)器TALEs[59]。

傳統(tǒng)的Golden Gate克隆法又叫IIS克隆法，是Engler等報(bào)道的一種由IIS型限制性核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的“無縫”連接的克隆策略。IIS型限制性內(nèi)切酶有一個(gè)結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)的域和一個(gè)專門切割DNA的功能域，常以二聚體形式作用于DNA序列，在識(shí)別位點(diǎn)之外切開DNA，產(chǎn)生具有黏性末端的DNA片段，再用連接酶將幾個(gè)DNA片段按照既定的順序拼接成不含酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA片段[56-58]。Engler等[57]采用此法將9個(gè)片段拼接入目的載體，經(jīng)過驗(yàn)證有90%的轉(zhuǎn)化子為正確的重組子，證明了其在多片段連接上的高效性。

圖7 Golden Gate克隆法 (X) 和Golden Gate AssemblyTM示意圖 (以Bas1酶為例，Y)[54-56,63]

此種方法采用未經(jīng)酶切的質(zhì)粒作為材料，優(yōu)點(diǎn)是可以解決PCR擴(kuò)增所帶來的堿基突變的問題，但是，它要求將所有待組裝的片段必須克隆到Golden Gate質(zhì)粒系統(tǒng)中，由于突出末端序列固定不變，大大降低了可以利用此法進(jìn)行拼接的目的基因的種類，是此法在應(yīng)用上的一個(gè)限制因素[60]。由于突出端序列的大小只有4 bp，那么在拼接反應(yīng)中突出末端至少有一個(gè)，最好有兩個(gè)堿基不同。當(dāng)目的片段的數(shù)目大于10或者突出末端的GC含量高度偏向一個(gè)極端時(shí)，那么可能無法找到一組能夠互相兼容的末端序列，那么在這種情況下就可以使用分級(jí)Golden Gate拼接法[61]。Weber等[62]和Werner等[63]將Golden Gate克隆法進(jìn)一步延伸成為一個(gè)模塊化的克隆策略 (Modular cloning，MoClo) 并以此方法分別完成了11個(gè)和17個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)錄片段的拼接。

Golden Gate拼接法 (Golden Gate AssemblyTMcloning kit) 與Engler的Golden Gate克隆法有所不同[55,64]，采用PCR擴(kuò)增的方法使載體線性化及得到目的基因片段，大大增加Golden Gate克隆法的應(yīng)用范圍。其基本步驟為 (圖7Y)：1) 實(shí)用軟件對目的基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析；2) PCR擴(kuò)增目的基因片段和線性化質(zhì)粒載體；3) 將基因片段和線性化載體加入含有IIS型限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶的緩沖液中 (合適條件下) 進(jìn)行反應(yīng)。

2 討論與展望

本文簡要介紹了目前已經(jīng)成熟的幾種新型載體構(gòu)建技術(shù)的原理、特點(diǎn)和應(yīng)用，并對幾種載體構(gòu)建方法作了一個(gè)綜合評價(jià)，表1中比較了7種不同載體構(gòu)建方法的特點(diǎn)，指出了這些方法的應(yīng)用方向和潛力?？梢钥闯觯蓚鹘y(tǒng)的構(gòu)建方法到Gateway技術(shù)，再到本文列舉的各種無酶連接的新方法，載體構(gòu)建方法已經(jīng)進(jìn)入了無酶連接的新階段。若構(gòu)建小片段載體時(shí)可嘗試基于寡核苷酸合成和競爭性連接原理的小片段基因載體構(gòu)建的方法；如果在構(gòu)建干擾載體時(shí)，若目標(biāo)miRNA存在特異性的骨架，可以采用MicroRNA前體PCR置換法，如果沒有特異性的骨架則使用In-Fusion試劑盒法更加簡便；需要多片段連接的復(fù)雜載體或添加標(biāo)記基因的載體可使用重組融合PCR法，而且利用此法可以引入突變位點(diǎn)，同時(shí)為研究基因功提供了新方法；若需要避開某些基因的功能區(qū)域或需要在不同位點(diǎn)快速插入不同的目的基因時(shí)，可以采用In-Fusion試劑盒法。若需要構(gòu)建多片段復(fù)雜植物表達(dá)載體，根據(jù)序列多少、大小、是否需要保留特殊結(jié)構(gòu)和經(jīng)濟(jì)等因素，在SLIC、Gibson等溫拼接、Golden Gate拼接法中合理選擇。隨著植物基因工程技術(shù)的不斷更新，各種植物載體構(gòu)建技術(shù)正不斷成熟，而其發(fā)展的必然趨勢是更加簡便、安全、通用、高效和經(jīng)濟(jì)。

表1 幾種主要構(gòu)建方法的綜合比較

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Methods for construction of transgenic plant expression vector: a review

Yangpu Zhang, and Shushen Yang

,,712100,,

Construction of recombinant plasmid vector for gene expression is a key step in making transgenic plants and important to study gene function and plant genetic engineering. A right choice of gene construction method can be cost-effective and achieve more diverse recombinant plasmids. In addition to the traditional methods in construction of plant gene expression vectors, such as Gateway technology, three DNA method and one step cloning, a few novel methods have been developed in recent years. These methods include oligonucleotide synthesis-based construction of small fragment gene expression vectors via competitive connection; construction of small RNA expression vector using pre-microRNA; recombination-fusion PCR method which inserts DNA fragments of multiple restriction sites into the target vector; and insertion of a DNA fragment into any region of a linear vector via In-Fusion Kit. Construction of complex vectors with many fragments uses sequence and ligation-independent cloning method, Gibson isothermal assembly or Golden Gate assembly. This paper summarizes our working experience in the area of recombinant vector construction and reports from others with an intention to disseminate ideas about currently widely used DNA recombination methods for plant transformation.

artificial pre-Mirco RNA, in-fusion kit, recombination-fusion PCR, Gibson isothermal assembly, Golden Gate assembly

May 6, 2014; Accepted: August 8, 2014

Shushen Yang. Tel: +86-29-87092262; E-mail:yangshushen2002@163.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31271625), State Key Laboratory of Soil Erosion and Dry land Farming on the Loess Plateau Foundation (No. 10502).

國家自然科學(xué)基金(No. 31271625)，黃土高原土壤侵蝕與旱地農(nóng)業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)(No. 10502) 資助。