蘇榮欣 ，李 偉，齊 崴 ，何志敏

(1. 天津大學化工學院化學工程聯(lián)合國家重點實驗室，天津 300072；2. 天津化學化工協(xié)同創(chuàng)新中心，天津 300072)

蛋白酶是目前商業(yè)化程度最高、應用最廣的一類酶[1]．堿性蛋白酶作為蛋白酶的一種，已被證明在洗滌添加劑[2]、食品、服裝、醫(yī)藥以及檢測試劑等行業(yè)具有很大的應用前景[3]．目前，對堿性蛋白酶的研究多集中在從不同的動物組織、植物組織和菌種中提取并純化堿性蛋白酶[4-11]．而對酶活的檢測一直使用傳統(tǒng)的比色方法[12-13]，檢測過程較為繁瑣，檢測靈敏度較低．有關(guān)檢測方法的研究極少報道．由于堿性蛋白酶的酶活一般較弱，開發(fā)一種可快速、準確且靈敏檢測堿性蛋白酶的方法極具現(xiàn)實意義．

金納米顆粒具有超小尺寸、良好生物相容性和較低的生物毒性，從而吸引了大量研究者的興趣．而熒光金納米簇不僅具有金納米顆粒的優(yōu)點，更具有良好的熒光性質(zhì)，因此被大量應用到熒光標記、生物檢測以及小分子檢測中[14-16]．近年來，蛋白合成金納米簇方法得以建立[17-19]，使得熒光金納米簇的應用范圍獲得進一步擴展[20]．

筆者利用以溶菌酶為模板合成的金納米簇，建立堿性蛋白酶濃度的定量檢測方法，考察金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比、反應溫度和反應時間對檢測靈敏度的影響規(guī)律，進一步確定該方法的檢測范圍和檢測限．

1 堿性蛋白酶檢測原理

本檢測方法的檢測原理如圖 1所示．在 pH為13的條件下，溶菌酶作為模板劑和還原劑合成由 25個金原子組成的金納米簇．在溶菌酶的保護下，金納米簇可以穩(wěn)定存在，并且保持熒光性能．保持 pH為13的條件下，加入堿性蛋白酶，堿性蛋白酶將包覆金納米簇上的溶菌酶水解，使金納米簇失去保護，從而使環(huán)境中的氧氣猝滅金納米簇的熒光[21]．本檢測方法就是利用堿性蛋白酶水解溶菌酶導致熒光猝滅，并根據(jù)熒光猝滅的程度對體系中堿性蛋白酶的含量進行準確、靈敏地檢測．由于在堿性條件下，其他蛋白酶的活性很低，因此本方法對堿性蛋白酶檢測具有較好的選擇性．

圖1 利用蛋白酶剪切作用檢測堿性蛋白酶的原理Fig.1 Schematic illustration of the detection of alkaline protease based on their scissor

2 實 驗

2.1 儀器與藥品

儀器：熒光光譜儀(安捷倫科技有限公司)；JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本 JEOL公司)；恒溫水浴搖床(優(yōu)萊博技術(shù)有限公司)；SevenGo? pH-SG2型pH計(梅特勒-托利多公司)；TU-1810型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)．

藥品溶菌酶(梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)；氯金酸(HAuCl4·4H2O，阿拉丁公司，上海)；實驗所用堿性蛋白酶(200,unit/g)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶均來自北京普博欣生物科技有限責任公司；配置緩沖液所用的氯化鉀和氫氧化鈉來自阿拉丁公司，均為分析純．

2.2 溶菌酶穩(wěn)定的金納米簇的制備

合成金納米簇所需玻璃容器均經(jīng)徹底清洗，并用王水(HNO3和 HCl體積比為 1∶3)浸泡，用雙蒸水充分沖洗并烘干后使用．以溶菌酶為模板合成金納米簇的方法參見文獻[17，22-23]．本實驗合成金納米簇的方法為：將 125,mg溶菌酶在快速攪拌的條件下溶解到 5,mL雙蒸水中，待充分溶解之后加入 5,mL 10,mmol/L的氯金酸溶液，室溫下充分混合 1～2,min，此時混合溶液變?yōu)樽厣褂?1,mol/L的氫氧化鈉溶液將混合溶液的pH調(diào)節(jié)到13，由于超過了溶菌酶的等電點，此時出現(xiàn)白色沉淀．在室溫下攪拌1～2,min后，將反應溶液轉(zhuǎn)入 37,℃恒溫水浴搖床中，200,r/min，反應 12,h．反應后溶液變?yōu)榧t色，避光冷藏待用．

2.3 檢測方法條件優(yōu)化

為了在短時間內(nèi)獲得最好的檢測效果，本實驗考察了金納米簇的制備時間、檢測反應溫度、溶菌酶比例及反應時間的影響，進而確定反應進行的條件．后續(xù)的檢測實驗按優(yōu)化后的條件進行．

2.4 堿性蛋白酶檢測

堿性蛋白酶檢測中所用到的緩沖溶液均提前過膜，防止雜質(zhì)對實驗結(jié)果的影響．將 10,mg堿性蛋白酶溶解到1,mL pH為13的氯化鉀-氫氧化鈉緩沖溶液中配制成 5,mg/mL的母液，而后稀釋成不同濃度的酶溶液．選擇 pH為 13的緩沖溶液是為了既保證堿性蛋白酶活性的條件，又不影響金納米簇的熒光性質(zhì)．在7,mL干凈的離心管中，依次加入2.7,mL不同濃度的堿性蛋白酶溶液和 3,mL金納米簇溶液，混勻后放入 40,℃的恒溫水浴搖床中，200,r/min，反應3,h．采用熒光光譜儀在激發(fā)光波長為532,nm的條件下檢測所得溶液在600～900,nm的發(fā)射光光譜.

3 結(jié)果與討論

3.1 金納米簇的表征

如圖2所示，在該實驗條件下合成的金納米簇粒徑在 3～10,nm 之間，大于藍光金納米簇粒徑[19]，較為符合文獻[17]所報道的發(fā)紅光金納米簇的粒徑．

在 350,nm 紫外光照射下，可以看到合成的金納米簇可以發(fā)出紅色熒光．使用熒光光譜儀進一步確定金納米簇的激發(fā)和發(fā)射光譜．如圖 3所示，所獲得的金納米簇的激發(fā)波長為 532,nm，在此激發(fā)波長下，金納米簇的發(fā)射波長為 670,nm左右．所有數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化處理．

圖2 金納米簇的透射電鏡圖Fig.2 TEM image of Au NCs

圖3 金納米簇的熒光激發(fā)(EX)和發(fā)射(EM)光譜Fig.3 Fluorescence excitation (EX) and emission (EM)spectra of Au NCs

3.2 實驗條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的檢測結(jié)果，本實驗考察了檢測體系中金納米簇與酶溶液比例、反應溫度、反應時間對檢測效果的影響．之后的檢測按照優(yōu)化后的條件進行．

3.2.1 反應機理驗證

為了驗證反應機理，檢測了金納米簇與堿性蛋白酶反應前后粒徑的變化．實驗結(jié)果如圖 4所示，曲線1對應未與堿性蛋白酶反應的金納米簇的粒徑分布，曲線 2對應 100,μg/mL堿性蛋白酶 2,700,μL，在 40,℃條件下與 300,μL金納米簇溶液反應 2,h后的粒徑分布．可以看到金納米簇粒徑在反應前后從 8,nm左右下降到 4,nm 左右，這證明了堿性蛋白酶與金納米簇表面包覆的溶菌酶相互作用，將溶菌酶水解，從而驗證了之前所設(shè)計的反應機理．

3.2.2 金納米簇與酶溶液比例的確定

由于堿性蛋白酶的酶活較弱，為了在短時間內(nèi)達到對堿性蛋白酶的有效檢測，檢測體系中酶溶液應占較大比例．這里考察了金納米簇溶液與 100,μg/mL堿性蛋白酶溶液體積比分別為 4∶6、2∶8、1∶9和5∶95條件下，在40,℃下反應2,h后熒光強度相對降低值(即熒光信號)(I0－I)/I0．結(jié)果如圖 5所示，熒光信號隨著堿性蛋白酶溶液比例的增高而增高．雖然體積比為5∶95時信號最強，但由于在該比例下熒光強度較弱，當酶濃度較低時，檢測信號波動較大．因此1∶9被選為后續(xù)實驗的標準比例．

圖5 不同金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比的熒光信號Fig.5 Fluorescence signals made by different volume ratios of Au NCs to alkaline protease solution

3.2.3 反應溫度的確定

由于堿性蛋白酶的最適溫度在 40～55,℃之間，本實驗分別檢驗了 37,℃、40,℃、45,℃、50,℃和 55,℃條件下，2.7,mL 100,μg/mL的堿性蛋白酶溶液與300,μL金納米簇溶液混合后熒光相對下降值(即熒光信號)(I0－I)/I0隨時間的變化．結(jié)果如圖 6所示，37,℃條件下，基本無熒光信號；40,℃、45,℃、50,℃和55,℃條件下，熒光信號均隨時間增加逐漸增強．雖然熒光信號的程度隨溫度升高而增強，但為了避免由于高溫對金納米簇熒光強度的影響，本實驗選取較溫和的條件，即40,℃，為反應溫度．

3.2.4 反應時間的確定

為了使本檢測方法可以在較短時間內(nèi)達到對堿性蛋白酶的靈敏檢測，考察了 0,μg/mL和 500,μg/mL堿性蛋白酶溶液可獲得的熒光信號隨時間的變化，以便選擇合適的反應時間．如圖 7所示，反應 60,min后，500,μg/mL和 0,μg/mL堿性蛋白酶所產(chǎn)生的熒光信號差別隨反應的進行逐漸增大．由于本方法將檢測較寬濃度范圍的堿性蛋白酶，故選擇反應時間為180 min．

圖6 不同反應溫度下熒光信號隨時間的變化Fig.6 Change of fluorescence signal with reaction time at different temperatures

圖7 堿性蛋白酶質(zhì)量濃度為 0,μg/mL 和 500,μg/mL 時熒光信號隨反應時間的變化Fig.7 Change of fluorescence signal with reaction time in 0 μg/mL and 500 μg/mL alkaline protease solution

3.3 堿性蛋白酶檢測曲線的建立

依照第2.2節(jié)方法進行堿性蛋白酶檢測實驗．實驗發(fā)現(xiàn)：當反應時間相同時，隨著酶濃度的增加，熒光強度降低更多．從圖 8可見，堿性蛋白酶質(zhì)量濃度與相應的熒光信號在對數(shù)坐標下呈線性，在 2～2,000,μg/mL 范圍內(nèi)成良好線性(R2＝0.986)，檢測限為 0.1,μg/mL(S/N＝3)．根據(jù)堿性蛋白酶的酶活值(200,unit/g)，檢測線性區(qū)間為 4×10-5～0.04,unit/mL，檢測限為 2×10-6,unit/mL．證明該方法可檢測的堿性蛋白酶含量線性范圍較大．

3.4 方法選擇性考察

為了考察本檢測方法對堿性蛋白酶檢測是否具有專一性，本實驗引入胃蛋白酶和胰蛋白酶作為蛋白酶類干擾物，引入葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶作為其他酶類干擾物．實驗中用到的所有酶的質(zhì)量濃度均為 500,μg/mL．干擾酶檢測實驗條件與堿性蛋白酶檢測相同．如圖 9所示，堿性蛋白酶所產(chǎn)生的信號明顯大于其他蛋白酶或其他種類酶，證明該檢測方法具有實際應用的可能．值得注意的是，胃蛋白酶的檢測信號為負值，說明加入胃蛋白酶后，金納米簇的熒光強度不降反增．這是因為胃蛋白酶在堿性條件下沒有剪切蛋白的活性，由于它本身也是一種蛋白，同樣可作為合成金納米簇的還原劑和穩(wěn)定劑．因此，在反應過程中，那些未被溶菌酶吸附還原的 A uCl4-有可能會被胃蛋白酶還原為熒光金納米簇，使熒光強度升高.

圖9 金納米簇對堿性蛋白酶和其他干擾物的熒光響應Fig.9 Fluorescence responses of Au NCs to alkaline protease and other interfering substances

4 結(jié) 語

本文利用堿性蛋白酶與金納米簇表面包覆的溶菌酶的相互作用，建立了一種堿性蛋白酶靈敏、高效的熒光檢測技術(shù)，研究了金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比、反應溫度和反應時間對檢測靈敏性的影響，發(fā)現(xiàn)當金納米簇與堿性蛋白酶溶液體積比為 1∶9、反應溫度為40,℃、反應時間為3,h的條件下，檢測效果最好．該方法檢測線性區(qū)間為4×10-5～0.04 unit/mL，檢測限為 2×10-6,unit/mL，同時為蛋白穩(wěn)定的熒光金屬納米簇拓展了一種新的生物檢測應用．

［1］ Rao M B，Tanksale A M，Ghatge M S，et al. Molecu-lar and biotechnological aspects of microbial proteases[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1998，62(3)：597-635.

［2］ Maurer K H. Detergent proteases [J]. Current Opinion in Biotechnology，2004，15(4)：330-334.

［3］ Gupta R，Beg Q K，Lorenz P. Bacterial alkaline proteases：Molecular approaches and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2002，59(1)：15-32.

［4］ Van Heyningen S，Secher D S. A new alkaline protease from Acremonium kiliense [J]. Biochemical Journal，1971，125(4)：1159-1160.

［5］ Eguchi M，Kuriyama K. Purification and characterization of membrane-bound alkaline proteases from midgut tissue of the silkworm，Bombyx mori [J]. Journal of Biochemistry，1985，97(5)：1437-1445.

［6］ Rivett A J. Purification of a liver alkaline protease which degrades oxidatively modified glutamine synthetase：Characterization as a high molecular weight cysteine proteinase [J]. Journal of Biological Chemistry，1985，260(23)：12600-12606.

［7］ Matsuzawa H，Tokugawa K，Hamaoki M，et al. Purification and characterization of aqualysin Ⅰ(a thermophilic alkaline serine protease)produced by Thermus aquaticus YT-1 [J]. European Journal of Biochemistry，1988，171(3)：441-447.

［8］ Monod M，Togni G，Rahalison L，et al. Isolation and characterisation of an extracellular alkaline protease of Aspergillus fumigatus [J]. Journal of Medical Microbiology，1991，35(1)：23-28.

［9］ Joo H S，Choi J W. Novel alkaline protease from the polychaeta，Periserrula leucophryna：Purification and characterization [J]. Process Biochemistry，2001，36(8/9)：893-900.

［10］ Miyaji T，Otta Y，Shibata T，et al. Purification and characterization of extracellular alkaline serine protease from Stenotrophomonas maltophilia strain S-1 [J]. Letters in Applied Microbiology，2005，41(3)：253-257.

［11］ Jellouli K，Ghorbel-Bellaaj O，Ayed H B，et al. Alkaline-protease from Bacillus licheniformis MP1：Purification，characterization and potential application as a detergent additive and for shrimp waste deproteinization [J]. Process Biochemistry，2011，46(6)：1248-1256.

［12］ Kembhavi A A，Kulkarni A，Pant A. Salt-tolerant and thermostable alkaline protease from Bacillus subtilis NCIM no. 64 [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，1993，38(1/2)：83-92.

［13］ Anson M L. The estimation of pepsin，trypsin，papain，and cathepsin with hemoglobin [J]. Journal of General Physiology，1938，22(1)：79-89.

［14］ Durgadas C V，Sharma C P，Sreenivasan K. Fluorescent gold clusters as nanosensors for copper ions in live cells [J]. Analyst，2011，136(5)：933-940.

［15］ Fang Y M，Song J，Chen J S，et al. Gold nanoparticles for highly sensitive and selective copper ions sensing—Old materials with new tricks [J]. Journal of Materials Chemistry，2011，21(22)：7898-7900.

［16］ Li J，Lin X. Simultaneous determination of dopamine and serotonin on gold nanocluster/overoxidizedpolypyrrole composite modified glassy carbon electrode[J]. Sensors and Actuators B：Chemical，2007，124(2)：486-493.

［17］ Xie J P，Zheng Y，Ying J Y. Protein-directed synthesis of highly fluorescent gold nanoclusters [J]. Journal of the American Chemical Society，2009，131(3)：888-889.

［18］ Kawasaki H，Hamaguchi K，Osaka I，et al. pH-dependent synthesis of pepsin-mediated gold nanoclusters with blue green and red fluorescent emission [J].Advanced Functional Materials，2011，21(18)：3508-3515.

［19］ Chen T H，Tseng W L. (Lysozyme type Ⅵ)-stabilized Au8 clusters：Synthesis mechanism and application for sensing of glutathione in a single drop of blood [J].Small，2012，8(12)：1912-1919.

［20］ Yuan X，Luo Z，Yu Y，et al. Luminescent noble metal nanoclusters as an emerging optical probe for sensor development [J]. Chemistry—An Asian Journal，2013，8(5)：858-871.

［21］ Wang Y，Wang Y，Zhou F，et al. Protein-protected Au clusters as a new class of nanoscale biosensor for labelfree fluorescence detection of proteases [J]. Small，2012，8(24)：3769-3773.

［22］ Wei H，Wang Z，Yang L，et al. Lysozyme-stabilized gold fluorescent cluster：Synthesis and application as Hg2＋sensor [J]. Analyst，2010，135(6)：1406-1410.

［23］ Hu L，Han S，Parveen S，et al. Highly sensitive fluorescent detection of trypsin based on BSA-stabilized gold nanoclusters [J]. Biosensors and Bioelectronics，2012，32(1)：297-299.