劉沛明

（廣西壯族自治區(qū)合浦縣疾病預防控制中心，廣西合浦536100）

萃取-水相乙基化衍生結合GC-CVAFS法測定大米和魚樣品中的甲基汞

劉沛明

（廣西壯族自治區(qū)合浦縣疾病預防控制中心，廣西合浦536100）

建立萃取-水相乙基化衍生結合GC-CVAFS測定大米和魚樣品中甲基汞的方法。應用堿消解和有機溶劑CH2Cl2萃取技術，將樣品中的甲基汞萃取出來并預富集至水相，而后進行乙基化反應，最后用GC-CVAFS聯用系統分離測定。實驗結果顯示：方法檢出限0.001 2ng/g，萃取前后標準樣品回收率分別為97%和95%，精密度RSD均小于5.8%。該方法快速、精密度高、檢測限低，能用于環(huán)境中痕量甲基汞的檢測與分析。

大米；魚；甲基汞；氣相色譜-冷原子熒光法

研究認為，國外和我國沿海地區(qū)，甲基汞主要通過食用海產品和魚類攝入，而在中國內地，食用大米是甲基汞暴露的主要途徑[9]。因此，本文以大米作為植物樣品，魚作為動物樣品，經過堿消解后，大米樣品用CH2Cl2萃取分離，魚樣經過水相乙基化-Tenax管富集，最后經氣相色譜和冷原子熒光法（GC-CVAFS）進行測定，此實驗前處理方便，樣品的測定精密度高。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：冷原子熒光儀（CVAFS）（Brooks Rand III，美國）；石英玻璃管（填充石英棉）、鎳鉻絲電熱線圈；150mL高硼硅酸玻璃氣泡瓶；高速離心機（3 500 r/min）；樣品振蕩機；Tenax-TA（Alltech，20/35目）富集管（Tenax，100mg）；數據處理軟件（Mercury Guru 4）；配有超級恒溫儀的氣相色譜柱（15%OV-3，Chromosorb W-AW80/100，內徑0.5 cm，長75 cm，美國Brooks Rand）；變壓器（0～220V）。

主要試劑：250 g/L KOH甲醇溶液；二氯甲烷（CH2Cl2，分析純）；去離子水；2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（136g乙酸鈉和59mL冰乙酸溶于去離子水中，定容至0.5L）；10g/L乙基化試劑（NaBEt4）（1.0g NaBEt4溶于100mL 20g/L KOH溶液，搖勻，冷凍避光保存）；干燥管（用顆粒狀的蘇打填充）；氯化甲基汞標準溶液（1μg/mL，Brooks Rand Ltd，美國）；標準樣品（Tort-2）。

1.2 樣品處理

1.2.1 堿消解

準確稱取0.1～0.2g干生物樣品（濕重：0.5～0.8g，m0），置于50mL特氟龍消解罐中。加入5mL預先配置的KOH甲醇溶液，用水浴消解或烘箱消解3h，消解溫度約75～80℃（用水浴鍋更安全，烘箱不穩(wěn)定易使消解罐變形）。消解過程中，每隔30min搖晃一次，使消解液與樣品充分接觸。消解完成后在常溫下冷卻至室溫，再加入濃HCl約3mL，同時作試劑空白試驗。

1.2.2 萃取和反萃取

將10mL CH2Cl2加入到消解液中并稱其質量（m1），加入到消解的大米和標準物質樣品Tort-2的離心管中，密封振蕩30min，再放入離心機中以3500 r/min離心25min，分層后抽掉上層消解液，轉移底部CH2Cl2至50mL的特氟龍瓶中，并稱其質量（m2），超純水定容至45mL。魚樣品和部分Tort-2不進行有機萃取，直接進行樣品測定。

1.2.3 反萃取到水相富集

將特氟龍瓶放在水浴鍋中，開始水溫控制在45～50℃下氣化可見CH2Cl2，然后再將溫度升高到80℃，以100～200mL/min的流速用N2吹脫約5min，以趕盡殘余的有機相，最后用去離子水定容待測。有機相中的甲基汞經過反萃取試驗后又被富集到水相中。

1.3 樣品測定

1.3.1 實驗操作流程

實驗操作流程如圖1、圖2所示。具體實驗操作步驟如下：

1）乙基化反應

在氣泡瓶中準確加入定量樣品，并添加超純水稀釋到50mL左右，加入200μL緩沖溶液（HAc-NaAc），隨后迅速加入100μL乙基化反應試劑（NaBEt4），迅速蓋上氣泡瓶瓶蓋，搖勻后放置15min讓其充分反應。經乙基化后反應產物為易揮發(fā)的甲基乙基汞（甲基汞和NaBEt4反應生成）和二乙基汞（Hg2+和NaBEt4反應生成）。

2）Tenax管富集有機汞

水相乙基反應完成后，通高純氮氣，以200～300mL/min的速度吹脫15min，使氣泡瓶中的乙基化產物富集在Tenax上（見圖1）。

圖1 乙基化反應和Tenax富集裝置

3）GC-CVAFS檢測

以50mL/min的氬氣為載氣通過Tenax管并連接到氣象色譜儀上，再將Tenax在20s內迅速升溫到80～120℃，使各種形態(tài)的汞釋放后隨著載氣進入到色譜柱（GC）中，由于分離系數不同的，甲基乙基汞和二乙基汞通過700～900℃的石英沙管，分解成單質汞進入到冷原子熒光檢測儀中（見圖2）。出峰包含3個峰，依次代表：Hg0、甲基汞和Hg2+。甲基汞標準和大米樣品色譜圖如圖3所示。

圖2 GC-CVAFS分離測定流程示意圖

圖3 甲基汞標準和大米樣品色譜圖

1.3.2 樣品濃度計算

分析樣品中的甲基汞含量以峰面積計算，公式如下：

式中：As——分析樣品甲基汞峰面積；

Ab——空白甲基汞峰面積；

SF——標準曲線斜率（見圖4）；

m0——稱取樣品的質量，g；

V0——樣品定容體積；

圖4 甲基汞的標準工作曲線

V1——加入到氣泡瓶中樣品體積，L；

m1——CH2Cl2初始加入量，g；

m2——萃取后轉移出來剩余CH2Cl2量，g。

式（1）用來計算經過萃取和反萃取樣品的濃度（大米和Tort-2），式（2）用來計算直接測定樣品的濃度（魚、頭發(fā)、血液和Tort-2）。

2 結果與討論

2.1 實驗參數優(yōu)化

在加入CH2Cl2后振蕩時，要使振蕩器的振蕩方向與離心管長度方向保持一致，且強度要大，保證消解液和CH2Cl2充分混合[10]。定容后加樣體積根據生物樣品甲基汞含量確定，無污染地區(qū)的大米、淡水魚加20mL足以檢測出，如海魚和一些污染地區(qū)的樣品，則加樣量應相應減少。氮氣吹脫時間達到15min，流速達到250mL/min時，水相中甲基汞可以全部被吹脫富集到Tenax管上；若吹脫速度加大，會降低Tenax的捕捉效率，速度降低，則需要加長氮氣的吹脫時間，所以流量一般設在250mL/min左右。實驗還表明，GC溫高，載氣速度快，出峰速度就越快，但可能造成峰分離不開；反之，則分離好，但可能造成峰型拖尾，出峰速度慢，所以需根據峰的分離情況調節(jié)柱溫和氣流速度。

研究表明，1mL 250g/L KOH甲醇溶液可以完全釋放0.25g干重生物樣品中的甲基汞[11]。本實驗中魚樣甲基汞含量較高，不需進行有機提取就可直接測定，如果含量較低的生物樣品，需萃取后才能測定，避免基質的干擾。研究還表明在乙基化反應過程中，pH在1～2左右，且二氯甲烷和氫氧化鉀/甲醇消解液體積比為3∶1時，經萃取和反萃取后的甲基汞回收率接近100%[11]。

2.2 標準曲線及檢出限

用1.0μL/mL甲基汞標準溶液配制1 ng/L的實驗標準溶液，分別吸取0，50，100，150，200μL于氣泡瓶，按照樣品測定的實驗步驟進行處理。以汞的絕對量（pg）為橫坐標，對應的積分面積為縱坐標制作標準曲線，如圖4所示。該測定系統的絕對最低檢測限為0.60pg，如稱0.50g樣品，將富集到水相的樣品全部加入到反應瓶中按上述步驟測定，則該方法的檢出限為0.0012ng/g。

2.3 方法的精密度和準確度

標準物質樣品測定值結果見表1，所有平行樣品測定5次，空白值均低于檢測限。萃取測定的Tort-2樣品標準平均回收率為95%，精密度為5.8%。堿消解后直接測定的標準物質樣品Tort-2平均回收率為97%，精密度為5.0%。

表1 標準物質樣品測定值

同時對已知甲基汞含量的大米和魚樣品加入已知量的甲基汞汞標，按照消解和萃取的實驗操作步驟分別對大米樣品和魚樣品做加標回收實驗，4組實驗結果見表2，加標回收率在94%～110%，平均回收率為101%。以上標準物質和加標回收實驗測定結果表明，此方法準確可行。

2.4 大米和魚樣品的測定

實驗樣品中的魚樣和大米樣品采自超市（n=6），大米來自6個品牌，魚的種類包括鯽魚、草魚、大黃魚和沙帶魚。大米中甲基汞含量范圍為0.11～2.3ng/g，平均值為2.1ng/g；魚體中甲基汞的測定顯示其含量范圍在5.8～70ng/g之間，平均含量為51 ng/g。部分大米和魚樣品平行測定結果見表3。

表2 大米和魚樣品中甲基汞加標回收實驗測定結果

表3 大米和魚樣品中甲基汞的含量

3 結束語

隨著人們對環(huán)境樣品中甲基汞含量檢測限和準確性要求的提高，高效、準確地測定甲基汞顯得尤為重要。本文采用堿消解、二氯甲烷萃取、水相乙基化、最后通過氣相色譜-冷原子熒光（GC-CVAFS）法來檢測大米和魚樣中的痕量甲基汞。該方法具有對樣品的選擇性小、步驟簡潔、快速和絕對檢測限低、精密度高等優(yōu)點，能滿足對環(huán)境中甲基汞檢測快速、準確的要求。

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Determ ination of methylmercury in rice and fish by gas chromatography-cold vapor atom ic fluorescence spectrometry and solvent extraction-aqueous phase ethylation

LIU Peiming
（The Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and prevention in Hepu County，Hepu 536100，China）

This paper stablished a determination method of methylmercury in rice and fish by gas chromatography-cold vapour atomic fluorescence（GC-CVAFS）with solvent extraction after aqueous phase ethylation.An alkaline digestion and an organic solvent（CH2Cl2）extraction technique were developed to extract the methylmercury in rice and fish.The extracted methylmercury samples were then pre-concentrated for aqueous phase ethylation.The last step was to determine the samples by gas chromatography-cold vapour atomic fluorescence.The experimental results have shows:the absolute detection limit is 0.001 2 ng/g；the average recovery of standard materials of extraction and nonextraction are 95%and 97%，respectively；and the relative standard deviation（RSD）is less than 5.8%.Thismethod can be also used to extract trace amounts ofmethylmercury contents in enviroment.

rice；fish；methylmercury；gas chromatographic-cold vapor atomic fluorescence spectrometric method

A文章編號：1674-5124（2015）06-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.06.013

0 引言

汞是一種高毒性污染物，能通過大氣長距離遷移造成全球性的污染，被我國列為優(yōu)先污染物。自然界中的汞以有無機態(tài)和有機態(tài)儲存在生物圈的各介質中。目前國內關于測定生物樣品中甲基汞的方法較多，有苯萃取-氣相色譜電子捕獲法[1-2]、液相色譜-原子熒光法（HPLC-AFS）[3]、萃取-液相色譜法[4]、甲苯萃取-原子熒光法（AFS）[5]、氣相色譜-原子吸收法（GC-AAS）[6-8]等。這些方法存在靈敏度低、精密度差、取樣量大、對樣品的要求較高，樣品前處理過程較繁瑣或所用試劑對人體健康有潛在危害等問題，很難準確快速地測定出環(huán)境生物樣品中的痕量甲基汞，所以，國外多采用萃取結合乙基化法，此方法精密度高。本文旨在簡化和優(yōu)化國內對植物和生物樣品中的甲基汞測定方法。

2014-11-28；

2015-01-09

劉沛明（1974-），男，主管技師，主要從事衛(wèi)生檢驗工作。