武海燕,邱 齡,劉 蓉,吳晨棟

飲食限制聯(lián)合維生素D對Beclin1表達的誘導(dǎo)作用

武海燕,邱 齡,劉 蓉,吳晨棟

目的探討維生素D聯(lián)合飲食限制誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生以及對自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達的影響。方法將18月老齡大鼠隨機分為對照組、維生素D組、飲食限制組、維生素D聯(lián)合飲食限食組,喂養(yǎng)6個月后,透視電鏡觀察大鼠肝臟細胞中的自噬體,免疫組化檢測大鼠腎皮質(zhì)細胞中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達情況。結(jié)果電鏡下維生素D組、飲食限制組、維生素D聯(lián)合飲食限制組均出現(xiàn)自噬細胞形態(tài)學(xué)改變。免疫組化顯示,與對照組相比,維生素D組、飲食限制組、維生素D聯(lián)合飲食限制組Beclin1蛋白表達的比值均明顯提高(P<0.01),且維生素D聯(lián)合飲食限制組Beclin1蛋白的表達高于維生素D組、飲食限制組(P<0.01)。結(jié)論兩種不同的檢測細胞自噬方法證實,維生素D以及維生素D聯(lián)合飲食限制均可增強細胞發(fā)生自體吞噬,且維生素D聯(lián)合飲食限制比單獨維生素D或者單獨飲食限制引起自噬的程度更高,提示維生素D與飲食限制可能通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。

自噬;維生素D;飲食限制;Beclin1蛋白

自噬是廣泛存在于真核細胞中的生命現(xiàn)象,是生物在其發(fā)育、老化過程中都存在的一個凈化自身多余或受損細胞器的共同機制。生命體籍此維持蛋白代謝平衡及細胞環(huán)境穩(wěn)定[1]。Beclin1參與自噬泡的形成過程,是新近被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物調(diào)控自噬性細胞死亡途徑的關(guān)鍵基因[2]。飲食限制(dietary restriction, DR)是指在提供生物體充分的營養(yǎng)成分如必需氨基酸、維生素等,保證生物體不發(fā)生營養(yǎng)不良的情況下,限制每日攝取的總熱量[1]。維生素D的激活形式1, 25-(OH)2D3作為一種多效型激素在人體許多不同的細胞中調(diào)控著將近900多種不同的基因表達,并調(diào)控他們的增殖、分化與存活[37]。

本研究旨在飲食限制以及維生素D(VD)干預(yù)的情況下,觀察老齡大鼠中自噬相關(guān)基因Beclin1的表達和自噬小體的比例,研究飲食限制聯(lián)合維生素D對細胞自噬的影響,探索飲食限制與維生素D是否通過不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心購進40只18月的老齡大鼠,JEM-100CX II型透射電鏡(日本日立HITACHI公司H-600),超薄切片機(瑞典LKB公司LKB-Ⅴ),活性VD(純度為99%)購自Sigma公司,Beclin 1兔抗大鼠單克隆抗體、EnVision抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒均購自武漢博士德公司。

1.2 動物處理 40只18月老齡大鼠經(jīng)洗脫期后隨機分為4組,對照組、飲食限制組(DR組)、維生素D組(VD組)、維生素D聯(lián)合飲食限制組(DR聯(lián)合VD組),喂養(yǎng)6個月,每周測大鼠體重,灌胃VD 3μg/kg。

1.3 投射電鏡檢測自噬小體 經(jīng)過常規(guī)取材、雙重固定、脫水、浸透、包埋、切片(厚度為50 nm),醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后,透射電鏡觀察、拍照、記錄。

1.4 免疫組化觀察腎皮質(zhì)細胞Beclin1蛋白的表達采用免疫組化法檢測,組織蠟塊切片,烤片后脫蠟和水化,高壓抗原修復(fù),依次滴加過氧化物酶阻斷液(37℃封閉40 min)、體積分數(shù)10%非免疫血清(37℃孵育40 min)、第一抗體(稀釋度均為1∶50,4℃過夜),生物素標記的第二抗體(37℃孵育20 min)及鏈酶親和素-生物素-辣根過氧化物酶工作液(37℃孵育20 min),DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片。用已知陽性切片作陽性對照,用PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,各組細胞自噬泡比值和Beclin1的表達采用單因素方差分析,兩組之間的進一步比較采用t檢驗,檢驗水準α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 電鏡觀察 自噬體為單層或雙層膜包裹著的處于不同降解階段的胞漿成分或廢棄的細胞器經(jīng)消化降解后形成的板層樣結(jié)構(gòu)。透射電鏡下正常組肝臟細胞內(nèi)脂滴較多,線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰,自噬體少見。限食組肝臟細胞內(nèi)線粒體豐富,腫脹明顯,自噬體數(shù)量較多。維生素D組肝臟細胞線粒體豐富,線粒體體積增大,自噬體數(shù)量較多。維生素D組聯(lián)合飲食限制組線粒體明顯腫脹,出現(xiàn)大量自噬體。詳見圖1、表1。

表1 各組自噬泡與胞漿面積的比值(±s)

表1 各組自噬泡與胞漿面積的比值(±s)

組別n自噬泡/胞漿面積對照組100.008 5±0.000 7 DR組100.013 3±0.001 11)VD組100.013 7±0.001 21)DR聯(lián)合VD組10 0.034 7±0.004 11)2)與對照組比較,1)P<0.01;與DR組、VD組比較,2)P< 0.01。

圖1 各組電鏡觀察結(jié)果

2.2 免疫組化顯示Beclin1蛋白表達增高 與對照組相比,DR組、VD組、DR聯(lián)合VD組腎皮質(zhì)細胞中Beclin1的表達明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01),且DR聯(lián)合VD組Beclin1蛋白的表達高于DR組、VD組(P<0.01)。詳見表2。

表2 不同組別Beclin1表達的比較(±s)

表2 不同組別Beclin1表達的比較(±s)

組別nBeclin1蛋白對照組100.165 0±0.007 9飲食限制組100.310 0±0.031 61)維生素D組100.340 0±0.200 51)維生素D聯(lián)合飲食限制組100.476 0±0.041 11)2)與對照組比較,1)P<0.01;與DR組、VD組比較,2)P< 0.01。

3 討 論

大量實驗表明飲食限制可以引起細胞自噬,是除遺傳操作以外強有力的延緩衰老方法,被稱為衰老研究領(lǐng)域重大的發(fā)現(xiàn)[8]。近年來有實驗發(fā)現(xiàn)活性維生素D也能夠引起細胞自噬,成為自噬與衰老領(lǐng)域新的研究熱點,但目前的研究尚不清楚二者是否通過相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細胞自噬。

自噬主要的生理功能是將胞質(zhì)中的大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、RNA、過量儲存的糖原等)和一些細胞內(nèi)源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破損的細胞器)在單位膜包裹的囊泡中大量降解,實現(xiàn)再循環(huán),以維持細胞自身的穩(wěn)定。這個過程對于細胞成分更新、保持旺盛的生理狀態(tài)是至關(guān)重要的[9]。自噬過程的信號調(diào)控目前有以下幾種:mTOR信號途徑、ClassⅠPI3K/PKB途徑、Gi3蛋白和氨基酸等。隨著年齡的增長,細胞自噬作用開始減弱,細胞適應(yīng)外界環(huán)境和自身防御反應(yīng)的能力降低,損傷的細胞結(jié)構(gòu)及大量氧自由基等不能有效地被清除,細胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化,加速細胞老化[10]。Beclin1是酵母菌atg/vps40基因在哺乳動物中的同源物,參與自噬泡的形成過程,是新近發(fā)現(xiàn)的哺乳動物調(diào)控自噬性細胞死亡途徑的關(guān)鍵基因[8]。Beclin1基因在多種正常組織中均有表達,因此可以通過檢測Beclin1蛋白的表達來間接反映自噬發(fā)生的強度。

電子顯微鏡是檢測細胞自噬的金標準[11]。自噬體是內(nèi)源性物質(zhì)包括細胞內(nèi)由于生理或病理原因而被損傷的細胞器,或過量儲存的糖原等,被細胞自身的膜(如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基復(fù)合體的膜)包裹形成。通過電鏡可對細胞的自噬體進行定量。

活性維生素D與細胞的自噬有著相關(guān)性,本實驗結(jié)果表示4組之間Beclin1蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且維生素D聯(lián)合飲食限制組Beclin1蛋白的表達高于維生素D組和飲食限制組。這些結(jié)果顯示,維生素D、飲食限制二者聯(lián)合可以誘導(dǎo)細胞自噬,且維生素D聯(lián)合飲食限制誘導(dǎo)細胞自噬比單獨的維生素D和單獨飲食限制作用更強,支持維生素D與飲食限制二者聯(lián)合具有疊加作用,但維生素D與飲食限制究竟通過什么信號途徑需要進一步探討。

參與自噬的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子十分復(fù)雜。TOR激酶是氨基酸、三磷酸腺苷(ATP)和激素的感受器,對細胞生長具有重要調(diào)節(jié)作用,抑制自噬的發(fā)生,是自噬的負調(diào)控分子,并發(fā)揮“門衛(wèi)(gatekeeper)”作用,哺乳動物細胞中的核糖體蛋白質(zhì)S6(p70S6)抑制自噬的發(fā)生,它位于TOR信號途徑下游,其活性受mTOR調(diào)節(jié)[12]。外源性氨基酸的去除,可以阻斷TOR信號途徑,因此飲食限制可能通過阻斷mTOR途徑來誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生。磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶AMPKα(5’AMP-activated protein kinase)是細胞體內(nèi)的一個感受能量的激酶,能夠感受AMP的變化,誘導(dǎo)自噬的發(fā)生,從而進行細胞內(nèi)物質(zhì)的降解重新產(chǎn)生能量[13]。AMPK 通過抑制雷帕霉素-1(mTORC1)位點來引起細胞自噬。維生素的活性形式1,25-(OH) 2D3可促進小腸對鈣磷的吸收,維持鈣磷正常代謝,調(diào)節(jié)腎臟對鈣磷的重吸收。維生素D經(jīng)血液維生素D結(jié)合蛋白(DBP)運送至小腸細胞,與細胞膜表面受體Cubilin和Megalin結(jié)合后,進入細胞核,與視黃醇類X受體(RXR),維生素D受體(VDR)復(fù)合物結(jié)合,并作用于目標基因的維生素D反應(yīng)元件,產(chǎn)生鈣結(jié)合蛋白。維生素D可能通過增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣調(diào)控蛋白[Ca2+]cyt,激活鈣離子依賴激酶CaMKK-β,進一步激活磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶AMPK誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生[14]。本實驗證明飲食限制和維生素D聯(lián)合誘導(dǎo)細胞自噬具有疊加作用,但目前機制尚不明確,因此維生素D和飲食限制引起細胞自噬的具體信號通路需要進一步的研究。

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R329.1

:Adoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.024

:1672-1349(2015)02-0200-03

2014-06-13)

(本文編輯郭懷印)

山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(太原030001)

邱齡,E-mail:oldnestle@aliyun.com