鄧錦松 宋海霞 (.中山市神灣鎮(zhèn)銘勝養(yǎng)殖場(chǎng)，廣東中山5846;.中山市海洋與漁業(yè)局漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣東中山58400)

網(wǎng)箱養(yǎng)殖花鱸體表細(xì)菌分離鑒定與感染草魚的研究*

鄧錦松1宋海霞2
(1.中山市神灣鎮(zhèn)銘勝養(yǎng)殖場(chǎng)，廣東中山528462;2.中山市海洋與漁業(yè)局漁業(yè)技術(shù)推廣站，廣東中山528400)

采用細(xì)菌分離純化方法，從患病花鱸體表分離出了5株菌株。通過生化試驗(yàn)和細(xì)菌16SrRNA基因序列測(cè)定，5株細(xì)菌初步鑒定I為野菊微小桿菌;II為乙酰微小桿菌;III－V為巨型球菌。用5株細(xì)菌分別感染健康草魚，5株細(xì)菌均具有致病性。在5個(gè)菌株中，巨型球菌對(duì)草魚的危害較大。

鱸魚;細(xì)菌;分子鑒定;16SrRNA

近年來，魚病發(fā)生頻繁，尤其是細(xì)菌性魚病的暴發(fā)，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。為了掌握危害魚類較大的病菌種類、同種細(xì)菌在不同種魚之間的相互傳播規(guī)律。

本研究對(duì)從患病花鱸體表分離的細(xì)菌菌株，通過形態(tài)學(xué)觀察及一系列生理生化試驗(yàn)，并采用16SrRNA基因序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果輸入到NCBI中，用BLAST工具，對(duì)序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析進(jìn)行鑒定［1］，并把分離的各菌株細(xì)菌分別對(duì)健康草魚進(jìn)行感染試驗(yàn)，觀察鱸魚致病細(xì)菌對(duì)草魚產(chǎn)生的影響，驗(yàn)證其致病性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原菌來源

患病花鱸于2013年5月采自饒平縣北部的湯溪水庫上游養(yǎng)殖場(chǎng)，從患病花鱸體表分離細(xì)菌。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

來源于同一養(yǎng)殖場(chǎng)的健康草魚300條。

1.2 菌株分離及細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

用無菌棉簽沾取患病花鱸的體表處，分別涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在27℃恒溫箱中培養(yǎng)12h，將長出的不同菌落分別轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，直到一個(gè)平板中只長有一個(gè)菌落［2］。然后將菌株分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，并將其放入27℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行搖菌12h，后分別將菌液濃度稀釋為1× 10－1、1×10－2、1×10－3、1×10－4、1×10－5、1×10－6進(jìn)行凃板，培養(yǎng)后對(duì)菌落的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀、顏色等情況進(jìn)行觀察并記錄。另挑取單菌落接種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，培養(yǎng)12h后進(jìn)行革蘭氏染色，觀察現(xiàn)象并記錄結(jié)果。

1.3 細(xì)菌鑒定

1.3.1 基因組DNA提取

取適量細(xì)菌于1ml無菌水的Ep管中，12000r/ min離心5min，吸去上清液，收集菌體。向Ep管中加入600μL裂解液(30mmol/Ltris－HCl，0.1mol/LEDTA，0.1mol/LNaCl，1%SDS，pH8.0)、20μL10mg/mL的蛋白酶K，充分混勻后置于55℃水浴1h。12000r/min離心5min，取上清液，向上清液中加入飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提后，12000r/min離心5min，取上清液，并向上清液加2倍體積的無水乙醇，冰上放置10min，12000r/ min離心5min，去掉上清液，置室溫干燥后，溶于30μLTE緩沖液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系如下:10×PCRbuffer5μL;25mol/L MgCl5μL;10uM引物各1ul;模板DNA5μL;Taq酶0.5μL;補(bǔ)足雙蒸水至50μL。其中，PCR擴(kuò)增的引物是由上海生工生物服務(wù)有限公司合成的FP (5'－GATTAGATACCCTGGTAGTCCAC－3')和RP (5'－CCCGGGAACGTATTCACCG－3')。反應(yīng)程序:94℃5min;(94℃30s;55℃30s;72℃1min) x30;72℃5min。

1.3.3 電泳

利用2%瓊脂糖凝膠電泳(3V/cm，1.5h)檢驗(yàn)總DNA的提取和PCR反應(yīng)結(jié)果。

1.3.4 測(cè)序

由上海生工生物服務(wù)有限公司完成。

1.3.5 序列分析

利用BLAST工具，對(duì)測(cè)定的細(xì)菌基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析，從而對(duì)細(xì)菌菌株進(jìn)行鑒定。

1.4 細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)

將花鱸體表的不同菌株分別接種在已制備好的各含有蔗糖、乳糖、麥芽糖、淀粉和甘露醇五種糖類的糖發(fā)酵管中進(jìn)行糖酵解試驗(yàn)［3］，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d后，觀察現(xiàn)象并記錄結(jié)果。按照常規(guī)方法對(duì)花鱸體表細(xì)菌進(jìn)行糖酵解試驗(yàn)、檸檬酸鹽培養(yǎng)基試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、尿素分析試驗(yàn)、V－P和甲基紅生理生化試驗(yàn)。

1.5 細(xì)菌的回復(fù)感染

感染試驗(yàn)前將菌株分別接種在制備好的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h，用平板菌落計(jì)數(shù)法［4］測(cè)定細(xì)菌原菌液中活菌數(shù)目，細(xì)菌菌株濃度(細(xì)菌密度)均為:106～107個(gè)/ml。

用于回復(fù)感染的健康草魚平均體長為10～15cm，體重150～200g，分五組，每組50條，同時(shí)設(shè)一對(duì)照組。將純化的單一細(xì)菌菌液以肌肉注射(1 ml/尾)方式感染到試驗(yàn)草魚胸鰭下的肌肉處，對(duì)照組注射相同劑量的蒸餾水。將以上試驗(yàn)魚置于60×30×28cm㎝的長方形的養(yǎng)魚箱中，持續(xù)充氧，連續(xù)觀察一周。

圖1 部分菌株的菌落形態(tài)(注:a為鱸體表II，b為鱸體表III)

2 結(jié)果

2.1 菌落外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果

將純化后的培養(yǎng)基取出，對(duì)細(xì)菌菌落的厚薄、大小、表面、邊緣、隆起形狀、顏色等進(jìn)行觀察(見圖1)。革蘭氏染色在油鏡下觀察(見圖2).通過比較外部形態(tài)及油鏡觀察結(jié)果，得到5個(gè)菌株，其外部形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果見表1。

圖2 部分菌落油鏡下的細(xì)菌形態(tài)(注:a為鱸體表II，b為鱸體表III)

表1 細(xì)菌菌落形態(tài)觀察和革蘭氏染色結(jié)果

2.2 菌株鑒定

對(duì)16SrRNA基因部分序列正反方向測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行拼接，結(jié)果輸入到NCBI(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)中，用BLAST工具，對(duì)序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析，所得結(jié)果見表2。

表25 個(gè)菌株與相似序列的菌種名稱、登錄號(hào)及同源性

2.3 細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)

對(duì)五菌株進(jìn)行的糖酵解及其它生理生化試驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，其結(jié)果見表3和表4。

2.4 細(xì)菌回復(fù)感染

將初步鑒定的5種細(xì)菌分別接種到健康草魚，5種細(xì)菌對(duì)草魚均治病、開始死亡時(shí)間、死亡率、主要癥狀有不同程度的影響，其結(jié)果見圖3及表5。

表3 細(xì)菌糖酵解試驗(yàn)結(jié)果

表4 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

表55 株細(xì)菌回復(fù)感染結(jié)果

圖3 部分菌株回復(fù)感染后的癥狀

3 分析與討論

本研究用微生物學(xué)常用的細(xì)菌分離純化方法，從患病花鱸體表分離出了5株菌株。通過分子生物學(xué)鑒定和生化試驗(yàn)，5株細(xì)菌初步鑒定I為野菊微小桿菌;II為乙酰微小桿菌;III為巨型球菌HT6;IV為巨型球菌JCSC5402;V為細(xì)菌MM5。

在淡水魚類養(yǎng)殖中，常見的細(xì)菌性魚病主要有爛鰓病、腸炎病、敗血癥和赤皮病等。在草魚細(xì)菌引起的疾病研究中，祖國掌(2001)的研究表明，草魚細(xì)菌性疾病，主要為細(xì)菌性敗血癥、細(xì)菌性爛鰓病、細(xì)菌性腸炎和細(xì)菌性綜合癥等4種，而氣單胞菌是草魚患病的主要條件致病菌［5］。在患病花鱸體內(nèi)細(xì)菌分離與分子鑒定研究中，王慶容(2010)的研究表明，引起花鱸患病的主要致病菌是嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌［6］。目前，有關(guān)嗜水氣單胞菌引起魚類及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的記載和報(bào)道已較多見，在世界不少國家和地區(qū)均檢出該菌，且已對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重危害。同時(shí)還可引起魚類、兩棲類、爬行類以及哺乳動(dòng)物發(fā)?。?－10］。但目前未見研究對(duì)野菊微小桿菌、乙酰微小桿菌、巨型球菌HT6、巨型球菌JCSC5402和細(xì)菌MM5對(duì)魚類和其它動(dòng)物致病報(bào)導(dǎo)，因而本研究從患病鱸魚體表分離出的5株菌株的鑒定及致病性，為了解和掌握魚類致病病源菌種類、為以后研究魚病防治奠定基礎(chǔ)。

從患病花鱸體表提取分離的細(xì)菌感染健康草魚，5株細(xì)菌均具有致病性，說明這些細(xì)菌并不是單一感染致病一種魚類，能夠相互交叉感染，而且每種細(xì)菌的致病、致死結(jié)果各不相同。從5種細(xì)菌回復(fù)感染草魚的結(jié)果表明，細(xì)菌MM5與巨型球菌HT6，對(duì)草魚的危害較大，感染后2d開始死亡，一星期后死亡率最高。

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S965.211

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1006－3188(2015)04－0033－05

2015－11－13

1第一作者:鄧錦松(1979.11－)，碩士，水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)，電子郵箱:jsdeng79@163.

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