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(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都 611130)

·生物工程·

乳脂酶酶解無水奶油制備天然奶味香精

何 洋1，包清彬1*，楊 洋1，趙華修2

(1.西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川成都 611130)

以開發(fā)具有發(fā)酵乳脂味、并伴有一定奶油香的天然奶味香精為目的，篩選酶品種和酶解底物，研究酶解時間、酶解溫度、pH、酶添加量、底物濃度對乳脂酶酶解無水奶油制備天然奶味香精的影響。以感官評分作為主要評定指標，酸價作為參考，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗分析與優(yōu)化。結(jié)果表明：在酶解時間6 h、酶解溫度50 ℃、pH6、乳脂肪酶添加量2.5%、底物質(zhì)量分數(shù)85%條件下所得的奶味香精，具有較濃郁的發(fā)酵乳脂味和一定的奶油香氣，香氣柔和、協(xié)調(diào)性較好。

乳脂酶；無水奶油；酸價；感官評分；奶味香精

奶味香精是使用最廣泛的食品用香精之一，在食品和飼料工業(yè)中都得到廣泛應(yīng)用。目前最常用的奶味香精，多以香蘭素、乙基香蘭素、內(nèi)酯等合成原料進行調(diào)配，往往具有一定的刺激性，存在缺乏天然感、愉悅度欠佳、留香時間短等缺點[1]；因此，開發(fā)天然、安全的奶味香精，是人們一直致力研究的課題。天然奶香香氣物質(zhì)組分一般包括醇類、醛類、酸類、酮類、酯類、內(nèi)酯、硫化物等，其香氣來源一是鮮奶中的天然香氣成分，二是乳品加工中形成的香氣成分，主要包括雙乙酰(2，3-丁二酮)、乙偶姻、丁位癸內(nèi)酯、丁位十二內(nèi)酯和牛奶內(nèi)酯等[2]。近年來有研究[3]表明，利用酶解技術(shù)酶法水解奶油(或稀奶油)是制備天然奶味香精的有效途徑，在一定條件下對奶油進行酶法水解，產(chǎn)生具有奶香味特征的化合物，可以使酶解底物增香150～250倍。

從市售的不同廠家生產(chǎn)的酶解奶油產(chǎn)品看，由于各自使用的酶不同，工藝條件不同，產(chǎn)品品質(zhì)、香氣差異較大，有的偏重奶脂味，有的偏重奶油香味，有的更具發(fā)酵奶味；因此，以酶解奶油生產(chǎn)天然奶味香精的工藝及條件，仍有根據(jù)產(chǎn)品需求等，深入研究的必要。

本研究重點開發(fā)一種具有發(fā)酵乳脂味為主體香并伴有一定奶油香味的天然奶味香精。為此，需要優(yōu)選適合的乳脂酶和酶解底物，確定香精的評定標準，在此基礎(chǔ)上，采用單因素試驗考察影響酶解的主要因素酶解溫度、酶解時間、pH、酶添加量、底物濃度對奶味香精品質(zhì)的影響，再以正交實驗對工藝條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

無水奶油：新西蘭原裝進口奶油(市售)； 稀奶油：市售；乳脂酶1(脂分解能力相對較強，脂合成及脂交換能力相對較弱)：蘇柯漢(濰坊)生物工程有限公司生產(chǎn)；乳脂酶2(脂合成及脂交換能力相對較強，脂分解能力相對較弱)：成都大帝漢克生物科技有限公司提供；電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司生產(chǎn)；數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-S4，金壇市醫(yī)療儀器長生產(chǎn)；恒溫振蕩器：SHA-B，金壇市富華儀器有限公司；乙醇、乙醚、KOH(均為分析純)，成都科龍試劑生產(chǎn)；蒸餾水：西華大學(xué)實驗室提供。

1.2酶解工藝

奶油→溶化→加水(調(diào)底物濃度)→乳化均質(zhì)→巴氏殺菌→降溫→調(diào)pH→添加乳脂酶→酶解→滅酶→酶解產(chǎn)物。

1.3奶味香精感官評價標準

以通過專業(yè)評香師篩選的市售奶油香精作為對照，選擇10位感官評定人員進行感官評價。評定指標主要由A奶香味香氣、濃度和愉悅度、B奶味柔和度及協(xié)調(diào)性、C異味濃度3個方面組成，每1個評定項目滿分均為10分。評定者根據(jù)表1對評定項目打分，將A、B、C項目分數(shù)疊加并求平均值為該樣品得分。

表1 感官評分標準

1.4酸價的測定

檢測所得酶解奶味香精酸價，可了解酶解程度與奶味香精感官品質(zhì)的關(guān)系，為品質(zhì)控制提供參考。參考GB/T 5530—2005，以中和1 g酶解物中的游離脂肪酸所需氫氧化鉀的質(zhì)量(以mg)表示其酸價[4]，計算公式為

(1)

式中：V為所用KOH標準溶液的體積，mL；c為KOH溶液濃度，moL/L；m為樣品的質(zhì)量，g；56.1為KOH的摩爾質(zhì)量，mg/moL。

2 結(jié)果與討論

2.1單因素實驗分析結(jié)果

2.1.1 乳脂酶篩選

乳脂酶一般包含微生物乳脂酶、天然乳脂酶、人工合成乳脂酶。不同乳脂酶活性不同且大多具有專一性，為將奶油中的某中不帶香味的脂肪酸專一性酶解成帶有特殊奶香味的短鏈脂肪酸，以獲得預(yù)期的奶香味，需對不同種類乳脂酶進行挑選優(yōu)化。在相關(guān)前期粗選實驗基礎(chǔ)上，本實驗比較了2種乳脂酶的酶解效果，實驗結(jié)果如圖1所示。乳脂酶1(蘇柯漢(濰坊)生物工程有限公司生產(chǎn))酶解程度及感官評分相對較高，為此，本實驗選用乳脂酶1(蘇柯漢(濰坊)生物工程有限公司生產(chǎn))作為實驗供體酶。

圖1 乳脂酶對酶解反應(yīng)的影響

2.1.2 底物對奶油酶解增香的影響

選擇無水奶油、稀奶油作為酶解底物，在酶解溫度50 ℃、酶添加量2.5%、底物質(zhì)量分數(shù)85%、pH 6的條件下進行酶解。以2 h為時間單位對酶解產(chǎn)物進行感官評分及酸價測定，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 底物對酶解反應(yīng)的影響

由圖2可知隨著時間的增加無水奶油、稀奶油感官評分及酸價總體呈上升趨勢，但無水奶油感官評分遠高于稀奶油，5 h后表現(xiàn)得更為明顯。其原因可能是乳脂酶活性的保持僅需極少量的水保持酶的活性分子構(gòu)象；因此只要能夠滿足保持乳脂酶活性分子構(gòu)象的水量，感官評分以及酸價就會隨著底物質(zhì)量分數(shù)的增高而增高[5]。因此選擇無水奶油作為酶解底物較為合適。

2.1.3 底物濃度對酶解增香的影響

乳脂酶只能作用于油水界面上，大多數(shù)乳脂酶的活性中心是由絲氨酸、天冬氨酸、組氨酸組成的三聯(lián)體[6]。脂肪酸包含疏水頭和親水尾(極性氨基酸或帶電荷的氨基酸殘基或碳水化合物)2部分組成，酶的活性中心與疏水頭的位置不同，但很靠近，疏水頭保證酶在底物上的定位；親水尾使酶分子在界面上的定向更為穩(wěn)定，因此酶在油水界面上具有較大的活性[7]。乳脂酶對底物的催化作用需要少量水分以維持酶分子構(gòu)象，使其酶分子活性位點最好地與底物分子結(jié)合并達到最好的催化效果。為此，設(shè)定酶解溫度50 ℃、時間6 h、酶添加量2.5%、pH 6，并選擇75%、80%、85%、90%、95%、100%(無水奶油含量)作為質(zhì)量分數(shù)梯度變化值，考察底物質(zhì)量分數(shù)對乳脂酶酶解奶油的影響。

圖3 底物質(zhì)量分數(shù)對酶解反應(yīng)感官評分的影響

圖4 底物質(zhì)量分數(shù)對酶解反應(yīng)酸價的影響

實驗結(jié)果如圖3、4所示，隨著時間的增加底物質(zhì)量分數(shù)不同的樣品感官評分及酸價都呈上升趨勢，但是感官評分在6 h后有所下降。由橫向及縱向比較可知，底物質(zhì)量分數(shù)為85%的樣品感官評分一直高于其他質(zhì)量分數(shù)梯度，且6 h達到峰值。此時反應(yīng)體系中少量的水恰好維持酶的活性分子構(gòu)象，反應(yīng)體系中水分含量超過85%底物質(zhì)量分數(shù)中的水分時，體系中的水分會影響感官品質(zhì)，因此85%為適合的質(zhì)量分數(shù)。

2.1.4 酶添加量對酶解增香的影響

設(shè)定酶解溫度50 ℃、pH6、底物質(zhì)量分數(shù)85%，考察乳脂酶不同添加量對感官評分及酸價的影響。

圖5 酶添加量對酶解反應(yīng)感官評分的影響

圖6 酶添加量對酶解反應(yīng)酸價的影響

圖5、6可見，隨著酶解時間及乳脂酶用量的增加，感官評分及酸價也隨之增加。酶添加量由0.5%增加到2.5%時感官評分逐漸上升，酶添加量大于2.5%時感官評分呈現(xiàn)一定程度的下降。此外，酸價在2～6 h增長較快，6 h后趨于平緩。由此可見，酶添加量2.5%、酶解時間6 h酶解產(chǎn)物奶香成分含量達到峰值，繼續(xù)增加酶用量并不利于酶解產(chǎn)物中奶香成分的增加，因此，2.5%的酶用量為較適合的酶添加量。

2.1.5 pH值對酶解增香的影響

乳脂酶分子活性中心對底物起催化作用的分子集團受pH的影響較大，在設(shè)定底物質(zhì)量分數(shù)85%、酶解溫度50 ℃、酶添加量2.5%的條件下，探討不同pH值對底物酶解反應(yīng)的影響。

圖7 pH對酶解反應(yīng)酸價的影響

圖8 pH對酶解反應(yīng)感官評分的影響

由圖7、8表明，pH值為8、9、10時乳脂酶可能部分失活導(dǎo)致感官評分及酸價較低。pH值為5、6、7時，隨著時間增加感官評分及酸價逐漸上升，2～6 h感官評分及酸價上升趨勢明顯，6 h后感官評分有所下降，酸價趨于平緩。由此可見，pH為6是酶解反應(yīng)較適合的pH值。

2.1.6 溫度對酶解增香的影響

酶解溫度對底物狀態(tài)及乳脂酶活性、分子構(gòu)象等具有較明顯影響，為此，在固定底物質(zhì)量分數(shù)85%、酶添加量2.5%、pH6的條件下，設(shè)定酶解溫度為30 、40、50、60、70、80 ℃，考察溫度對酶解反應(yīng)的影響。

圖9 溫度對酶解反應(yīng)感官評分的影響

圖10 溫度對酶解反應(yīng)酸價的影響

實驗結(jié)果如圖9、10所示，在30～60 ℃、2～6 h范圍內(nèi)進行酶解，感官評分及酸價都在上升，其中50 ℃實驗組感官評分相對較高，6 h后變緩，酸價也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢。70 、80 ℃實驗組，隨時間變化酸價變化不明顯，感官分值較低，其原因可能是酶活性中心遭到破壞導(dǎo)致酶失活。由此可見，50 ℃是較適合的酶解溫度。

2.2正交實驗對酶解奶油增香條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用正交實驗對影響酶解反應(yīng)的主要因素進行優(yōu)化，采用5因素4水平實驗設(shè)計，以L16(45)正交表，因素水平見表2，正交實驗結(jié)果見表3。

表2 L16正交水平表

由表3可以看出，影響酶解物感官品質(zhì)的主次因素為A =C > D> B > E，即底物質(zhì)量分數(shù)=pH>溫度>酶添加量>酶解時間。最佳的工藝條件為A2B3C2D2E2,即底物質(zhì)量分數(shù)85%、酶添加量2.5%、pH6、溫度50 ℃、酶解時間6 h。

在上述最佳酶解條件下，進行3次驗證實驗，所得酶解奶味香精感官評定平均分值為7.58，酶解奶油酸價值為63.65 mg/g，酶解奶味香精發(fā)酵乳脂味香氣濃郁，愉悅度好。經(jīng)專業(yè)評香師評定，所得酶解奶味香精具有較強的天然發(fā)酵乳脂味并伴有一定的奶油香，香氣、香韻協(xié)調(diào)性好，天然感強，達到了項目設(shè)定要求。

3 結(jié)論

利用乳脂酶酶解奶油開發(fā)一種發(fā)酵乳脂味為主體香并伴有一定奶油香的天然奶味香精，以感官評定為主要考察指標，酸價為輔助考察指標，通過單因素及正交實驗，得到無水奶油是適合的酶解底物，最佳工藝條件為底物質(zhì)量分數(shù)85%、溫度50 ℃、pH6、酶解時間6 h、酶添加量2.5%，該工藝條件下制得的酶解物具有較濃厚的發(fā)酵乳脂味并伴有一定奶油香，香氣濃郁、醇厚，香氣協(xié)調(diào)性好。

[1]孔凌，劉超，喻麟，等.酶解奶油增香物制備工藝及其在奶香飼料調(diào)味劑中的應(yīng)用[J].飼料工業(yè)，2012(4):22-25.

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[7]王蓓.酶法制備天然牛奶風(fēng)味基料及牛奶香精的研究[D].無錫：江南大學(xué),2009.

(編校：葉超)

StudyonHydrolysisofAnhydrousMilkFatbyMilkLipaseforNaturalFlavoringAgent

HE Yang1,BAO Qing-bin1*,YANG Yang1,ZHAO Hua-xiu2

(1.BioengineeringCollege,XiHuaUniversity,Chengdu610039China;2.ChengduGreatHankbiologicalLtd,Chengdu611130China))

The effect of hydrolysis time, hydrolysis temperature, pH, concentration of substrate on active hydrolysis of Anhydrous Milk Fat by milk lipase for natural flavoring agent as well as screening types of enzymes and enzymatic substrate were investigated. On the other hand the sensory evaluation as the major index. Hydrolysis of Anhydrous Milk Fat in different condition was researched, and orthogonal experiment anlysis and optimization were utilized.. Experiment results show that the conditions as followed: hydrolysis time 6h, the concentration of the substrate 85%, temperature 50℃, pH=6,addition amount of milk lipase 2.5%，are the best experimental design.

lipase; anhydrous milk fat; acid value; sensory evaluation; milk flavor

2014-05-28

教育部春暉計劃項目(Z2012018)

：包清彬(1962—)，男，教授，主要研究方向為食品科學(xué)與糧食工程。E-mail:bao717@126.com

TS202.3

：A

：1673-159X(2015)02-0098-5

10.3969/j.issn.1673-159X.2015.02.020

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