劉祥，俱雄，陳春琳

(陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001)

大腸埃希菌(Escherichia coli)廣泛存在于自然環(huán)境中，按其致病機(jī)理可分為產(chǎn)腸毒素性、腸道侵襲性、腸道致病性、腸集聚黏附性和腸出血性5種[1]，可引起人畜共患病[2]，包括腹瀉[3]、腦膜炎[4]、尿道感染[5]、食物中毒[6]等；由其導(dǎo)致的奶牛乳房炎發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，給奶制品生產(chǎn)及品質(zhì)帶來重大影響[7–8]。大腸埃希菌外膜蛋白酶 T(outer membrane protease T, OmpT)位于細(xì)菌外膜，是大腸埃希菌的主要毒力相關(guān)因子之一[9]，可提高細(xì)菌抵抗宿主免疫系統(tǒng)的能力[10–11]，也是細(xì)菌進(jìn)入中樞神經(jīng)的黏附因子[4]，并介導(dǎo)細(xì)菌在尿路上皮細(xì)胞的定植[12]。此外，OmpT具有很高的免疫原性，能有效提高小鼠對(duì)致病性大腸埃希菌的免疫抵抗能力[13]，所以，OmpT有望成為候選的蛋白亞單位疫苗。本研究中利用分子克隆方法獲得大腸埃希菌OmpT蛋白表達(dá)菌株；純化OmpT蛋白，免疫小鼠，制備小鼠OmpT抗血清；通過正交試驗(yàn)確定OmpT適宜的表達(dá)條件與培養(yǎng)條件，旨在為OmpT工業(yè)發(fā)酵與疫苗開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

E. coli K12菌株、E. coli DH5a菌株、E. coli BL21菌株和pET–32a質(zhì)粒均由陜西理工學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

DNA聚合酶、連接酶及內(nèi)切酶購于大連寶生生物工程公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購于上海生物工程有限公司；IPTG購于BBI公司；二抗購于Sigma公司，基因測(cè)序在北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組載體的構(gòu)建

依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫公布的E. coli K12的全基因組序列設(shè)計(jì) ompT 基因引物。引物序列為Sense和Anti– sense Primer(5′–gctctcgagttaaaatgtgtactta ag–3′)(下劃線分別表示限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)BamHⅠ和Xho Ⅰ)。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：PCR緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 μmol/L引物各1 μL，模板DNA 10 μL，Taq 酶0.2 μL，補(bǔ)水至25 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性3min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s)，最后72℃充分延伸10min，4℃保溫。用PCR產(chǎn)物和pET–32a質(zhì)粒載體進(jìn)行雙酶切，用連接酶連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21表達(dá)菌株，進(jìn)行OmpT表達(dá)[14]檢測(cè)。

1.2.2 重組蛋白的表達(dá)檢測(cè)與純化

選取經(jīng)鑒定后的重組菌接入LB(Amp)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1∶100轉(zhuǎn)接到新鮮LB培養(yǎng)基中，待OD600nm約為0.5時(shí)，加入終濃度0.5 mmol/L 的IPTG，37℃誘導(dǎo)5 h，收集菌體，用蛋白電泳檢測(cè)OmpT表達(dá)情況。利用SDS–PAGE電泳方法[15]對(duì)OmpT進(jìn)行蛋白純化。

1.2.3 小鼠多克隆抗體制備

將每只昆明鼠免疫OmpT蛋白50μg，第1次采用弗氏完全佐劑，免疫14 d后進(jìn)行第2次免疫，第2次免疫7 d后，進(jìn)行第3次免疫。第3次免疫7 d后于小鼠眼部取血，將血清置于4℃冰箱中過夜析出，離心取上清，–80℃冰箱中保存?zhèn)溆肹15]。

1.2.4 蛋白抗體的效價(jià)與特異性檢測(cè)

用ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)，主要步驟為：將OmpT蛋白溶解至0.05μg/μL，在對(duì)應(yīng)的96孔板中加入100 μL抗原，37℃孵育3 h；倒空液體，清洗3次，加入300 μL封閉液，37℃孵育2 h，加100 μL不同稀釋度小鼠抗血清(每種稀釋度均有3個(gè)重復(fù))，37℃孵育30min；充分洗滌后加入100 μL二抗(1∶3 000稀釋)，37℃孵育30min；充分洗滌后，每孔加入50 μL底物A與50 μL底物B的混合液，37℃避光顯色10min，迅速加入終止液，酶標(biāo)儀[16]450 nm讀數(shù)。

采用Western blotting方法檢測(cè)OmpT小鼠抗血清特異性[17]，主要步驟為：將大腸埃希菌過夜培養(yǎng)，收集菌體，SDS–PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)NC膜，加入不同稀釋度的小鼠抗血清(對(duì)照加入陰性抗血清)，洗滌后，加入二抗(1∶3 000稀釋)孵育，洗滌后DAB顯色。

1.2.5 OmpT 蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

利用NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的細(xì)菌OmpT氨基酸序列，通過 MEGA5.02 軟件進(jìn)行聚類分析，并采用Neighbour–Joining 方法[14]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.6 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

選用L9(34)正交試驗(yàn)確定蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的適宜條件。正交試驗(yàn)分為培養(yǎng)條件與蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件兩部分[18]，試驗(yàn)的因子與水平見表1和表2。

表1 表達(dá)菌株培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)的因子與水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for cultural condition of strain expression

表2 蛋白誘導(dǎo)條件正交試驗(yàn)的因子與水平 Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for protein induced condition

OmpT表達(dá)菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)：將重組菌株置于LB(Amp)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，以1∶100(體積)轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基，按照正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵笈囵B(yǎng)，并記錄所得菌液的OD600nm。

OmpT表達(dá)菌株誘導(dǎo)條件優(yōu)化的正交試驗(yàn)：根據(jù)表達(dá)菌適宜培養(yǎng)條件試驗(yàn)結(jié)果，依照正交試驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵蟮牟煌瑮l件培養(yǎng)至合適OD600nm，加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo)相應(yīng)時(shí)間。分別吸取1mL菌液離心，將沉淀加入200 μL的2×SDS 上樣緩沖液中，沸水煮樣，并上樣10 μL 進(jìn)行SDS–PAGE電泳。使用Phoretix 1D軟件對(duì)獲得的蛋白電泳條帶進(jìn)行光密度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建結(jié)果

圖1 大腸埃希菌ompT基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果 Fig.1 PCR amplification electrophoresis of E. Tgene

從大腸埃希菌基因組中PCR擴(kuò)增到約1 000 bp的片段，片段大小與預(yù)期大小一致(圖1)。將由PCR 擴(kuò)增得到的目的基因與pET–32a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，通過連接酶連接轉(zhuǎn)化DH5a菌株，提取重組質(zhì)粒，雙酶切，獲得約1 000 bp的片段，片段大小與預(yù)測(cè)大小一致(圖2)?；驕y(cè)序結(jié)果表明，構(gòu)建的ompT基因的序列與NCBI公布的序列相同，證明重組質(zhì)?？寺〕晒Α?/p>

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果 Fig.2 Results of recombinant plasmid digested by restriction enzyme

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果

為檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況，將重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，蛋白電泳獲得相對(duì)分子質(zhì)量約56 000的蛋白條帶，其中包含約35 000的OmpT蛋白和20 400 的融合蛋白標(biāo)簽，其大小與預(yù)期大小一致；采用SDS–PAGE蛋白電泳切膠純化獲得的OmpT蛋白如圖3所示。

圖3 OmpT蛋白的表達(dá)與純化電泳圖譜 Fig. 3 Expression and purification electrophoresis of OmpT protein

2.3 小鼠抗血清效價(jià)與特異性檢測(cè)結(jié)果

對(duì)獲得的小鼠OmpT抗血清采用ELISA法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其抗體效價(jià)可以達(dá)到1∶1 600(圖4)。Western blotting方法的分析結(jié)果表明，不同稀釋度OmpT抗血清出現(xiàn)明顯條帶，而對(duì)照無對(duì)應(yīng)條帶(圖5)，表明OmpT抗血清可與OmpT蛋白特異性結(jié)合，OmpT蛋白小鼠多克隆抗體被成功制備。

圖4 OmpT 多克隆抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 Fig.4 Polyclonal antibody titer of the OmpT

圖5 OmpT 多克隆抗體特異性的Western blotting 檢測(cè)結(jié)果 Fig.5 Specificity of OmpT polyclonal antibody identification using Western blotting

2.4 OmpT 蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖6可見，不同種大腸埃希菌有聚在一起的趨勢(shì)，間接說明OmpT蛋白在不同種大腸埃希菌間具有同源性，可能存在交叉的免疫保護(hù)作用。

圖6 OmpT 氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig.6 Phylogenetic tree from OmpT amino acid sequences

2.5 重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)

2.5.1 菌株最適培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)結(jié)果(表3)的極差值(表4)可以看出，各因子對(duì)表達(dá)菌株生長的影響從大到小依次為培養(yǎng)基裝液量、葡萄糖濃度、轉(zhuǎn)速。由極差分析獲得的表達(dá)菌培養(yǎng)的最優(yōu)組合為a1b3c1(葡萄糖濃度為0，轉(zhuǎn)速為230 r/min，培養(yǎng)基裝液量為50mL)。表5方差分析結(jié)果顯示，葡萄糖濃度、轉(zhuǎn)速及裝液量對(duì)表達(dá)菌株培養(yǎng)的影響達(dá)到顯著水平。

表3 表達(dá)菌株的培養(yǎng)結(jié)果 Table 3 Results of the cultural experiment for strain expression

表4 表達(dá)菌株培養(yǎng)條件的極差分析結(jié)果 Table 4 Range results of cultural condition for strain expression

表5 表達(dá)菌株不同培養(yǎng)條件下OD600 nm 的方差分析結(jié)果 Table 5 Variance analysis of cultural condition for strain expression

2.5.2 OmpT 蛋白適宜誘導(dǎo)表達(dá)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

將正交試驗(yàn)獲得的表達(dá)菌株進(jìn)行SDS–PAGE電泳(圖7)，用Phoretix 1D軟件分析電泳條帶圖譜，獲得蛋白條帶的光密度值如表6所示。由表7中的極差分析結(jié)果可知，各因子對(duì)OmpT蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響從大到小依次為誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)時(shí)菌體OD600nm、IPTG誘導(dǎo)終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間。由極差分析獲得最適宜OmpT蛋白表達(dá)的組合為e3f2g2h2(加IPTG誘導(dǎo)菌液的OD600nm為1.0，IPTG終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，誘導(dǎo)溫度為32℃)。表8中的方差分析結(jié)果顯示，加IPTG菌液濃度、IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)溫度3個(gè)因子對(duì)OmpT蛋白表達(dá)的影響達(dá)到顯著水平。

圖7 正交試驗(yàn)獲得的OmpT 表達(dá)菌株SDS–PAGE 電泳圖譜 Fig.7 SDS–PAGE electrophoresis of OmpT strain expression from orthogonal experiment

s表6 OmpT 蛋白表達(dá)各試驗(yàn)的光密度值 Table 6 Value of optical density from different expression experiments of OmpT protein

表7 OmpT 蛋白表達(dá)各試驗(yàn)光密度值的極差分析結(jié)果 Table 7 Range analysis on the value of optical density from different expression experiments of OmpT protein

表8 OmpT 蛋白表達(dá)各因子光密度值的方差分析結(jié)果 Table 8 Variance analysis on the value of optical density from different expression experiments of OmpT protein

3 結(jié)論與討論

大腸埃希菌是導(dǎo)致奶牛乳房炎疾病的主要細(xì)菌之一，給奶制品業(yè)帶來的損失巨大[7–8]。OmpT蛋白是大腸埃希菌主要的外膜蛋白之一，具有顯著的免疫保護(hù)作用[13]，有望制備成奶牛乳房炎疾病的候選蛋白疫苗。本研究中構(gòu)建大腸埃希菌OmpT表達(dá)菌株，獲得純化的OmpT蛋白，免疫小鼠制備了特異性較好的OmpT多克隆抗體，為OmpT功能研究奠定基礎(chǔ)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)OmpT氨基酸序列在不同種類大腸埃希菌間具有同源性，可能為不同種類的大腸埃希菌感染提供交叉免疫保護(hù)作用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明：未誘導(dǎo)時(shí)，菌體適宜培養(yǎng)條件為葡萄糖濃度0 %，轉(zhuǎn)速230 r/min，裝液量50mL。有研究發(fā)現(xiàn)充足的氧氣以及合適的轉(zhuǎn)速有利于菌體的生長[19]。這與本實(shí)驗(yàn)證實(shí)提高培養(yǎng)基轉(zhuǎn)速，減少裝液量，可增加細(xì)菌對(duì)氧氣、營養(yǎng)的充分吸收結(jié)果一致。在菌株IPTG誘導(dǎo)后，適宜OmpT蛋白誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)時(shí)IPTG菌液OD600nm為1.0，IPTG終濃度0.3 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間8 h，誘導(dǎo)溫度32℃。IPTG是β–半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)，高濃度的IPTG具有一定的細(xì)胞毒性，抑制蛋白的表達(dá)[20–21]。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)低濃度IPTG(0.3 mmol/L)有利于蛋白的表達(dá)。

[1] Rosano G L，Ceccarelli E A．Recombinant protein expression in Escherichia coli ： Advances and challenges[J]．Fronties in Microbiology，2014，5：172．

[2] Hussein A H，Ghanem I A，Eid A A，et al．Molecular and phenotypic characterization of Escherichia coli isolated from broiler chicken flocks in Egypt[J]．Avian Dis Avian，2013，57(3)：602–611．

[3] Premjani V ， Tilley D ， Gruenheid S ， et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli OmpT regulates outer memb biogenesis[J]．FEMS Microbiol Lett，2014，355(2)：185–192．

[4] Wan L，Guo Y，Hui C Y，et al．The surface protease ompT serves as Escherichia coli K1 adhesin in binding to human brain micro vascular endothelial cells[J]．Pak J Pharm Sci， 2014，27(3)：617–624．

[5] Obaid J M，Mansour S R，Elshahedy M S，et al. Uropathogenic Escherichia coli isolates with different virulencegenes content exhibit similar pathologic influence on Vero cells[J]．Pol J Microbiol，2014，63(1)：43–49．

[6] Rawa S V，Sarreal C Z，Mandrell R E. Strain differences in fitness of Escherichia coli O157：H7 to resist protozoan predation and survival in soil[J]. PloS One，2014，9(7)：e102412．

[7] 余婷，安慧慧，吳聰明，等．奶牛乳房炎分離大腸桿菌的耐藥性及脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型研究[J]．中國獸醫(yī)雜志，2013，49(9)：6–11．

[8] 徐繼英，劉俊林，李先波，等．我國部分地區(qū)奶牛乳房炎源大腸桿菌生物學(xué)特性及耐藥性分析[J]．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2012，20(9)：1035–1041．

[9] 惠長野，郭研，吳書馳，等．大腸桿菌 K1 致病株外膜蛋白 T 體外功能[J]．微生物學(xué)報(bào)，2010，50(1)：48–53．

[10] Hui C Y，Guo Y，He Q S，et al．Escherichia coli outer membrane protease OmpT confers resistance to urinary cationicpeptides[J] ． Microbiol Immunol ，2010，54(8)：452–459．

[11] Koprivnjak T ， Peschel A ． Bacterial resistance mechanismanginst host defense peptides[J]．Cell Mol Life Sci，2011，68(13)：243–2254．

[12] Premjani V ， Tilley D ， Gruenheid S ， et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli OmpT regulates outer membrane vesicle biogenesis[J]．FEMS Microbiol Lett，2014，355(2)：185–192．

[13] 佟春玉，李潤婷，呼瑞，等．重組大腸桿菌外膜蛋白OmpT 對(duì)小鼠免疫保護(hù)作用的研究[J]．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35(8)：658–662．

[14] 劉祥．福氏志賀菌2型外膜蛋白A的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J]．動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36(5)：6–10．

[15] 陳春琳，劉祥，王成富，等．重組銅綠假單胞菌外膜蛋白 OprI 的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J]．生物技術(shù)，2015，25(1)：23–27．

[16] 劉祥，陳春琳，王揚(yáng)科，等. 小鼠骨橋蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備與鑒定[J]．中國蓄牧獸醫(yī)，2015，42(5)：1069–1075．

[17] 劉祥，陳春琳，牟歡，等．重組人骨硬化蛋白的表達(dá)、純化及多克隆抗體制備[J]．生物技術(shù)，2014，24(6)：68–72．

[18] 劉祥．溶藻弧菌附著定植因子ACFA 原核載體構(gòu)建、表達(dá)條件優(yōu)化及多克隆抗體制備[J]．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，30(1)：35–41．

[19] Xua M ， Suna Q ， Sua J ， et al ． Microbial transformation ofgeniposide in Gardenia jasminoides Ellis intogenipin by Penicillium nigricans[J]．Enzyme and Microbial Technology，2008，42(5)：440–444．

[20] Yildirim N，Mackey M C．Feedback regulation in the lactose operon：A mathematical modeling study and comparison with experimental data[J] ． Biophysical Journal，2003，84(5)：2841–2851．

[21] 劉祥．銅綠假單胞菌外膜蛋白 F 原核載體構(gòu)建、表達(dá)條件優(yōu)化及免疫保護(hù)作用研究[J]．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2015，25(11)：12–16．