毛 順 （江蘇省常熟市第五人民醫(yī)院,江蘇常熟215500）

·基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)·

吡嘧司特對(duì) OVA哮喘小鼠模型肺組織 IL-4m RNA、IL-5m RNA及IL-13m RNA表達(dá)的影響

毛 順 （江蘇省常熟市第五人民醫(yī)院,江蘇常熟215500）

【摘 要】目的:了解口服吡嘧司特對(duì)IL-4mRNA、IL-5mRNA 及IL-13mRNA在小鼠哮喘模型肺組織的表達(dá)的影響,為臨床治療提供幫助和指導(dǎo).方法:將40只SPF級(jí)的雄性BALB/C小鼠,采用隨機(jī)分組方法分為對(duì)照組、哮喘組、開瑞坦組及吡嘧司特組,每組10只.哮喘組、開瑞坦組及吡嘧司特組使用卵清白蛋白（OVA,Grade V）致敏液建立哮喘模型,對(duì)照組以生理鹽水代替OVA.同時(shí)給予開瑞坦組及吡嘧司特組模型小鼠連續(xù)四周分別喂養(yǎng)開瑞坦及吡嘧司特干預(yù)處理,并設(shè)立對(duì)照組,RT-PCR法檢測(cè)四組小鼠肺組織IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA表達(dá)水平.結(jié)果:IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA在對(duì)照組小鼠肺組織呈低表達(dá),在哮喘組中表達(dá)明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.開瑞坦、吡嘧司特組小鼠IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA的表達(dá)抑制,且開瑞坦組與吡嘧斯特組在療效上無明顯差異（P＞0.05）.結(jié)論:吡嘧司特可能通過下調(diào)IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA的表達(dá)在哮喘治療中發(fā)揮作用,在急性期治療作用明顯.

【關(guān)鍵詞】吡嘧司特;開瑞坦;哮喘;炎性因子表達(dá)

0 引言

支氣管哮喘（bronchial asthma,BA）是由多種細(xì)胞,包括炎癥細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中心粒細(xì)胞等）、氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞（平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞）等和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病,是兒童常見的慢性呼吸道疾病之一,且發(fā)病率高［1-2］.據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)顯示,全球每年約有1 500萬人因哮喘喪失勞動(dòng)能力,而我國(guó)哮喘患者的發(fā)病率、死亡率都呈逐年增高趨勢(shì)［3］.哮喘病因情況復(fù)雜,在易感環(huán)境或因素下容易反復(fù)發(fā)作,是一種可控卻難治的疾?。?］.因此,在對(duì)哮喘的相關(guān)研究中,發(fā)病機(jī)理、控制和預(yù)防是研究重點(diǎn).2013-09/2014-10本研究通過觀察吡嘧司特對(duì)哮喘小鼠肺組織IL-4、IL-5及IL-13mRNA表達(dá)的影響,探討吡嘧司特能否抑制氣道炎癥介質(zhì)的表達(dá),從而有效控制哮喘發(fā)作.

1 材料和方法

1.1 材料 Balb/c小鼠,體質(zhì)量20～25g,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院傷害分院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;402型超聲霧化器（上海合力醫(yī)療器械廠）.卵清白蛋白（OVA,GradeⅡ～Ⅴ,生產(chǎn)批號(hào):20130413）和氫氧化鋁膠囊（500 g/瓶,生產(chǎn)批號(hào):20130220）由美國(guó)Sigma公司提供;吡嘧司特（10 mg,生產(chǎn)批號(hào):20130418）由南通飛馬制藥有限公司生產(chǎn),開瑞坦（10 mg,生產(chǎn)批號(hào): 20130405）由先靈葆雅公司生產(chǎn).TRIzol由invitroge提供,RT-PCR試劑盒由Promega公司提供;PCR引物有上海生工公司提供.

1.2 方法

1.2.1 哮喘模型的建立與取材 4 0只Ba l b/c小鼠,鼠齡7周,體質(zhì)量20～26 g,隨機(jī)分為4組,哮喘組、吡嘧司特組、開瑞坦組、對(duì)照組,每組10只,飼養(yǎng)于20～25℃的恒溫箱中.哮喘組、吡嘧司特組、開瑞坦組小鼠均在第1、8日腹腔注射0.5 m L OVA混懸液（含OVA 100μg）致敏,第15日起予OVA 10 g/L溶液超聲霧化激發(fā),30 min/d,連續(xù)7 d.對(duì)照組小鼠在第1、8日腹腔注射0.5mL生理鹽水（NS）,第15日起予以霧化吸入NS 30 min/d,連續(xù)7 d.開瑞坦組小鼠在霧化吸入1 h后,予開瑞坦5 mg/kg口服,連續(xù)4周.吡嘧司特組霧化吸入1 h后,予吡嘧司特5 mg/kg口服,連續(xù)4周.哮喘組霧化吸入1 h后,予安慰劑5 mg/kg口服,連續(xù)4周.于首次激發(fā)4周后處死小鼠,迅速取下左肺組織冷凍后研磨,備用提取總蛋白及RT-PCR檢測(cè)IL-4、IL-5、IL-13mRNA表達(dá)水平.切取右肺組織用0.9%氯化鈉注射液洗凈,10%甲醛固定后脫水,之后浸蠟包埋制作成蠟塊,切片5μm行HE染色.

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)肺組織IL-4、IL-5、IL-13mRNA表達(dá)水平 肺組織冰凍后置于研缽中碾碎,采用TRIzol一步法提取總RNA［5］.以所得到的組織總RNA為模板,使用Promega公司的試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),得到相應(yīng)的cDNA.RT-PCR選用β-actin為內(nèi)參照,以逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模檢測(cè)各組標(biāo)本IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)量.PCR反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性 5 min.反應(yīng)條件為:95℃ 45 s,然后 59℃45 s,64℃50 s,72℃45 s,共22個(gè)循環(huán)后,延伸72℃10min.反應(yīng)結(jié)束后,以18srRNA為內(nèi)參照物,由電腦軟件分析計(jì)算結(jié)果.對(duì)于樣本總RNA濃度的差異,用最終目的基因的結(jié)果除以內(nèi)參基因來校正.HMGB1引物設(shè)計(jì)由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information,NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得基因序列,經(jīng)primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì),由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成.序列如下: Sequence Name:IL-4F

IL-4F:5′-GGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3′

IL-4R:5′-GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT-3′102 bp

Sequence Name:IL-5F

IL-5F:5′-CTCTGTTGACAAGCAATGAGACG-3′

IL-5R:5′-TCTTCAGTATGTCTAGCCCCTG-3′102 bp

Sequence Name:IL-13F

IL-13F:5′-CCTGGCTCTTGCTTGCCTT-3′

IL-13R:5′-GGTCTTGTGTGATGTTGCTCA-3′106 bp

β-actin F:5′-GACGGGGTCACCCACACTGT-3′

β-actin F:5′-AGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3′528 bp

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.01統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析.計(jì)量數(shù)據(jù)以表示.多組間均數(shù)比較采用x2檢驗(yàn).方差齊性時(shí)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）,方差不齊時(shí)用Welch校正.以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 肺組織HE染色 肺組織HE染色后對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn),哮喘組小鼠的支氣管及肺間質(zhì)周圍被大量嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞所浸潤(rùn),黏膜下層增寬,皺裙增多,管腔變狹窄,平滑肌層血管豐富且增厚.而對(duì)照組支氣管上皮完整,無炎性表現(xiàn),各組織形態(tài)正常（圖1）.

圖1 小鼠肺組織HE染色（×100）

2.2 肺組織IL-4、IL-5、IL-13 m RNA變化 IL-4、IL-5、IL-13各組之間比較結(jié)果均為哮喘組、開瑞坦組及吡嘧司特組均明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.其中哮喘組又明顯高于開瑞坦組及吡嘧司特組,而開瑞坦組與吡嘧司特組組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05,表1）.

表1 RT-PCR測(cè)定四組小鼠肺組織IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)比較 （n=1 0,x±s）

表1 RT-PCR測(cè)定四組小鼠肺組織IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)比較 （n=1 0,x±s）

aP＜0.05 vs對(duì)照組;cP＜0.05 vs開瑞坦組及吡嘧司特組.

組別 IL-13 IL-5 IL-4哮喘組 0.943±0.199ac1.162±0.218ac1.449±0.398ac開瑞坦組 0.498±0.1358a0.450±0.068a0.450±0.125a吡嘧司特組 0.518±0.225a0.611±0.158a0.340±0.235a對(duì)照組 0.021±0.009 0.021±0.009 0.028±0.005

3 討論

哮喘屬于慢性氣道炎癥性疾病,目前,其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制尚未研究透徹.大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為支氣管哮喘與氣道的水腫、黏液分泌及多種炎性介質(zhì)的啟動(dòng)和放大有關(guān)［6-7］.而氣道的慢性炎癥,在炎癥的反復(fù)刺激下,演變?yōu)楹粑澜Y(jié)構(gòu)改變,造成氣道重塑.許多研究表明,輔助T細(xì)胞的平衡失調(diào)與哮喘密切相關(guān),特別是Th2細(xì)胞,其在哮喘發(fā)病中占主要地位,它的優(yōu)勢(shì)分化和產(chǎn)生的細(xì)胞因子在炎癥部位高表達(dá).原因是氣道炎癥時(shí),Th2細(xì)胞功能亢進(jìn),抗原進(jìn)入體內(nèi)后細(xì)胞被激活,開始大量分泌IL-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子［8-10］.這些因子進(jìn)一步激活B細(xì)胞,合成特異性的IgE,使得體內(nèi)的變態(tài)反應(yīng)加?。?1］.為此,本研究通過觀察吡嘧司特在哮喘小鼠肺組織中的IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-13mRNA細(xì)胞因子的表達(dá),分析其在哮喘治療中的效果.

IL-4、IL-5及IL-13具有很強(qiáng)的促炎癥作用,并與多種自身免疫病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān).IL-4是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因素,是合成IgE細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)控制中心,主要通過加強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的活性來起到炎性作用.IL-5則可以促進(jìn)原始的Th細(xì)胞分化成Th17細(xì)胞,加強(qiáng)嗜酸性粒細(xì)胞的聚集,誘導(dǎo)炎性反應(yīng)［12-14］.而IL-13是作為一種效應(yīng)細(xì)胞因子, 在T淋巴細(xì)胞活化和促進(jìn)中有顯著作用,是由Th2細(xì)胞產(chǎn)生的代表性細(xì)胞因子之一［15］.目前,哮喘的治療仍然以藥物治療為主,其中激素、茶堿、β2-受體激動(dòng)劑等藥物的使用不僅副作用明顯,且全身或局部的不良反應(yīng)給患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響［16］.為此,本研究中所使用的吡嘧司特,是一種新的過敏介質(zhì)阻釋劑.在肺組織、外周血、腹膜等組織中,吡嘧司特能抑制抗原-抗體反應(yīng),激活因子降低 IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-13mRNA的表達(dá).同時(shí)吡嘧司特還能抑制白細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流及細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放,降低Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)介導(dǎo)的過敏［17］.研究結(jié)果顯示,哮喘組、開瑞坦組及吡嘧司特組小鼠在致敏后出現(xiàn)抓鼻、呼吸頻率加快、點(diǎn)頭呼吸、步態(tài)不穩(wěn)等癥狀.病理學(xué)檢查顯示哮喘小鼠的支氣管及肺間質(zhì)周圍被大量炎性細(xì)胞所浸潤(rùn),出現(xiàn)水腫.而3組小鼠的肺部組織中IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13 mRNA水平明顯高于對(duì)照組,在經(jīng)過開瑞坦及吡嘧司特治療4周后,肺部組織中IL-4mRNA、IL-5mRNA及IL-13mRNA水平明顯降低,與哮喘組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,說明兩種藥物治療對(duì)哮喘是有效的.吡嘧司特在降低小鼠Th2細(xì)胞因子水平、糾正平衡失衡、抑制氣道黏液分泌、保護(hù)氣道不受炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等方面作用明顯.

綜上所述,本研究結(jié)果表明哮喘模型小鼠肺部炎癥是由多種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)引起的病理過程,通過相互重疊、相互促進(jìn)和相互抑制使得疾病難以治愈.吡嘧司特在哮喘小鼠治療中,可以通過下調(diào)IL-4mRNA、IL-5mRNA、IL-13mRNA的表達(dá)來發(fā)揮作用,且治療效果明顯,在急性期治療作用突出,是一種有效的控制和治療哮喘的藥物,為支氣管哮喘的治療提供了新的思路.

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The effect of pem irolast on IL-4mRNA, IL-5mRNA and IL-13m RNA expression in lung tissue of asthm atic m ice

MAO Shun
Fifth People's Hospital of Changshu,Changshu 215500,China

【Abstract】AIM:To study the effect of orally adminstrated Pemirolast on expression of IL-4mRNA, IL-5mRNA and IL-13mRNA in lung tissue of asthmaticmousemodel and provide help and guidance for clinical treatment.METHODS:A total of 40male BALB/C and specific pathogen freemice were randomly divided into control group,asthma group,Claritin group and Pemirolast group,witn 10 mice in each group.Asthma group, Claritin group and Pemirolast group established mouse asthma model by ovalbumin（OVA,Grade V）,while control group used saline instead of OVA.The asthma model mice in Claritin and Pemirolast group were fed with Claritin and Pemirolast for four weeks continuously and expression levels of IL-4mRNA, IL-5mRNA and IL-13mRNA in lung tissue were detect by RT-PCR.RESULTS:The expression of IL-4mRNA,IL-5mRNA and IL-13mRNA in lung tissue of control group was low but was significantly high in asthmatic group with statistically significant difference（P＜0.05）.The expression of IL-4mRNA,IL-5mRNA and IL-13mRNA were inhibited in Claritin and Pem irolast group and difference of treatment efficacy between Claritin and Pemirolast group was not statisticatty significant（P＞0.05）.CONCLUSION:Pem irolast possibly plays a role in the treatment of asthma by reducing IL-4mRNA,IL-5mRNA and IL-13mRNA expression and has evident effects in acute stage.

【Keywords】pemirolast;claritin;asthma;expression of inflammatory cytokines

【中圖分類號(hào)】R392.5;R256.12

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

文章編號(hào):2095-6894（2015）07-001-03

收稿日期:2015-04-25;接受日期:2015-05-10

作者簡(jiǎn)介:毛 順.本科,主治醫(yī)師.研究方向:呼吸內(nèi)科. E-mail: jscsms@163.com