熊川，李小林，李強(qiáng)，鄭林用,3*

(1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610065；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066)

羊肚菌因其菌蓋有不規(guī)則的凹陷且多具褶皺，外形似羊肚而得名[1]。作為享譽(yù)世界的美味食用菌和藥用菌，羊肚菌受到越來越多的關(guān)注。由于自然界中可供人類利用的羊肚菌資源十分有限，許多學(xué)者很早就開始研究羊肚菌的人工栽培[2]。羊肚菌生活史周期復(fù)雜，發(fā)生地環(huán)境多樣，使得其人工栽培一直沒有取得大的進(jìn)展[3]。羊肚菌半人工栽培時(shí)，播種后都需要覆蓋往年發(fā)生過羊肚菌的土壤，即只有完成“覆土”操作[4–7]，才可能收獲羊肚菌子實(shí)體。這說明羊肚菌發(fā)生地土壤中有某些理化或者微生物因素能夠有效刺激羊肚菌的再發(fā)生。自然界中大多數(shù)微生物由于難于模擬其生長繁殖的真實(shí)條件而不能獲得純培養(yǎng)[8]，因此，若要更好地了解微生物的群落結(jié)構(gòu)及其在自然生態(tài)系統(tǒng)中的作用，還需要其他的補(bǔ)充技術(shù)。自從1993年變性梯度凝膠電泳(denaturinggradientgel electrophoresis，DGGE)被引入微生物生態(tài)學(xué)以來，該技術(shù)已被廣泛地用于比較微生物群落的多樣性和監(jiān)視種群動態(tài)，在土壤微生物、大型食藥用真菌內(nèi)生菌研究方面已經(jīng)有了許多成功的應(yīng)用[9–13]。該技術(shù)能夠有效提供群落中優(yōu)勢種類信息，可以平行分析多個(gè)樣品，具有檢測極限低、重復(fù)好和操作容易等特點(diǎn)，適合于調(diào)查種群的時(shí)空變化，并且可通過對切下的條帶進(jìn)行序列分析或結(jié)合特異性探針雜交分析來鑒定群落的成員，展示群落結(jié)構(gòu)的多樣性。本研究中以羊肚菌自然發(fā)生地土壤為材料，采用擴(kuò)增土壤細(xì)菌16S rDNA目的片段和變性梯度凝膠電泳(DGGE)相結(jié)合的方法，探討羊肚菌菌塘土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，以期從微觀角度來評價(jià)土壤群落結(jié)構(gòu)與多樣性對羊肚菌發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1 樣地環(huán)境調(diào)查

采用孟珍貴等[14]的方法完成樣地環(huán)境調(diào)查。采用GPS定位羊肚菌分布區(qū)，詳細(xì)調(diào)查區(qū)域植物種類組成、郁閉度、地貌類型、海拔高度、坡度、坡向、坡位等生境因子，拍攝照片，并逐項(xiàng)填寫調(diào)查表。

1.2 樣品采集與處理

于2013年9月15日在冕寧縣后山鄉(xiāng)采集土壤樣品(后山鄉(xiāng)野兒塘的一處山地有羊肚菌發(fā)生)。在該地域選定5處樣點(diǎn)，除去地表枯枝落葉層，采樣。將土樣混勻，用于土樣理化性質(zhì)測定。在羊肚菌發(fā)生地隨機(jī)選取4個(gè)菌塘，采集羊肚菌子實(shí)體和菌塘土壤。每個(gè)樣點(diǎn)按土壤表層以下0～10 cm(A層，4個(gè)菌塘分別記作1A、2A、3A、4A)和10～20 cm(B層，4個(gè)菌塘分別記作1B、2B、3B、4B)分層采集土樣，3次重復(fù)。用同樣的方法采集環(huán)境相似卻未發(fā)生羊肚菌的土壤作為對照(A層和B層分別標(biāo)記為5A和5B)。用無菌手套采樣，土樣采后立即裝入已滅菌的封口聚乙烯袋, 迅速放入冰盒保存，并及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。采樣數(shù)據(jù)記錄見表1。

表1 樣地的經(jīng)緯度和海拔高度 Table 1 Plot location information of this study

將采集回的土壤樣品分成兩部分：一部分土壤風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)測定 (土壤氮、磷、鉀含量和有機(jī)質(zhì)含量測定用《土坑農(nóng)化分析》第3版中的方法[15]，速效磷含量測定用鉬銻抗比色法[15]；速效鉀含量測定用火焰光度法[15]，速效氮含量測定用CaCl2浸提流動注射分析儀法[15]，有機(jī)質(zhì)含量測定用重鉻酸鉀容量法(稀釋熱法)[16])另一部分用于土壤DNA的提取。獲得的DNA樣品置于-20℃保存。

1.3 主要試劑

DNA marker、2×Taq PCR Master Mix購于天根公司；PCR膠回收試劑盒、pUCm–T載體試劑盒、大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自TAKARA；D3390–02 E.Z.N.A. TM Soil DNA Kit (200)真菌DNA 提 取 試 劑 盒 購 于OMEGA 公 司；PCR 引 物968f–GC、1401r和968f由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性研究

1.4.1 土壤總DNA 的提取

采用美國OMEGA公司的Soil DNA Kit(D200)試劑盒，按操作說明對土壤進(jìn)行總DNA的提取與純化，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.2 PCR 擴(kuò)增

16S rDNA V6-V8區(qū)的PCR擴(kuò)增：以提取的總DNA 為 模 板，用 細(xì) 菌 通 用 引 物968f–GC(5′– GCclamp–AACGCGAAGAACCTTAC–3′) 和1401r (5′–CGGTGTGTACAAGACCC–3′)進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物5′端有40 bp GC夾(5′–CGCCCGCCGCGCCCC GCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC–3′)[17]。為減少非特異性擴(kuò)增，試驗(yàn)中采用降落PCR法。反應(yīng)體系預(yù)設(shè)為50 μL：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。反應(yīng)條件：94 °C預(yù)變性5min；94 °C變性30 s，61～56 °C退火30 s，72 °C延伸1min，10個(gè)循環(huán)(其中每個(gè)循環(huán)退火溫度降低0.5 °C)；94 °C變性30 s，56 °C退火30 s，72 °C延伸1min，25個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸10min。所得PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)及圖像分析

利用DcodeTMUniversal Mutation Detection System系統(tǒng)(Bio–Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。從每個(gè)樣品PCR產(chǎn)物中取200 ng DNA加入到6%的聚丙烯酰胺凝膠中，凝膠的變性范圍為40%～65%(100%變性相當(dāng)于7 mol/L尿素和40%去離子甲酰胺)。電泳條件：在溫度60 °C和電壓80 V條件下電泳12 h；電泳緩沖液為1×TAE。電泳完畢后，經(jīng)SYBRgreen Ⅰ(1∶10 000稀釋)染色45min，經(jīng)超純水脫色后，用Bio–Rad公司的凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并用圖形分析軟件(Quantity One 4.5，Bio–Rad)對凝膠圖像進(jìn)行分析。香農(nóng)指數(shù)(H)、豐度(S)、均勻度(EH)和辛普森指數(shù)(Si)等[18]指標(biāo)被用來描述與比較各個(gè)樣品的細(xì)菌多樣性。

1.4.4 DGGE 條帶切膠測序及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)DGGE圖譜，挑選一些共有或特有的優(yōu)勢條帶，用無菌手術(shù)刀片把選定的條帶從凝膠上切割下來，隨即浸泡于50 μL超純水中，4 °C過夜。用所得的浸提液作為模板進(jìn)行新一輪PCR擴(kuò)增，引物分別為不含GC夾的968f和1401r。采用1.4.2中的體系及步驟完成擴(kuò)增。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒(OMEGA) 進(jìn)行純化后與克隆載體pMDTM19–T(Vector試劑盒，寶生物，大連)連接，得到的陽性克隆送Invitrogen公司(上海)測序。將測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析，找出相似序列, 使用MEGA 5.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行，主要完成土壤理化性質(zhì)分析和土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地環(huán)境調(diào)查結(jié)果

樣地位于四川省涼山州西昌市冕寧縣后山鄉(xiāng)，海拔高度1 840 m，年均溫17.2℃，平均最低氣溫(1月)9.63℃，年均日照時(shí)間2 347 h，年均降水量1 018.8 mm，平均相對濕度為61.4%。該地域有多種大型珍稀食用、藥用菌生長(圖1)。樣地處于山中坡，東偏南15°，具有干熱河谷稀樹灌叢帶到云南松林過渡帶特征。樣地為疏林樣地，郁閉度0.2，地表覆蓋有少量松針，有稀疏苔蘚Bryophyta科植物生長。有狗尾草Setaria sp.等禾本科的雜草生長，同時(shí)發(fā)現(xiàn)腎蕨(Nephrolepis sp.)和大量的紫莖澤蘭(Ageratina adenophora)，高大喬木有松樹(Pinus sp.)，但較為稀疏。樣地土壤呈棕黃色，為沙棕壤，顆粒致密，黏度低，保水性差，但由于苔蘚、松針的覆蓋，整體濕度較大。樣地土壤pH為6.67，有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、全鉀的含量分別為2.53%，0.12%，0.04%，2.02%，堿解氮、有效磷、速效鉀含量分別為130，3.4，159mg/kg。

圖1 羊肚菌的形態(tài)及生長土壤環(huán)境 Fig.1 Morphology of Morchella and soil environment

2.2 菌塘土壤細(xì)菌DGGE 圖譜分析

DGGE圖譜直觀地展現(xiàn)了羊肚菌菌塘土與對照土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異(圖2)，共有條帶表示相應(yīng)的土壤類型之間可能存在一些共有的細(xì)菌物種，但條帶亮度的不同也間接反映出這些物種在土壤中的豐度高低。特殊條帶則表示某一類物種僅存在于某一類型或深度的土壤中。羊肚菌菌塘土細(xì)菌多樣性明顯強(qiáng)于對照樣品。各個(gè)泳道條帶數(shù)量有所不同，且各條帶的強(qiáng)度和遷移率存在差異，顯示出一定的細(xì)菌多樣性。1A–1條帶在菌塘土與非菌塘土樣 品中都有分布，是采樣地土壤的優(yōu)勢菌落，2A–1、4A–1條帶是菌塘土的優(yōu)勢菌落。

圖2 羊肚菌發(fā)生地土壤細(xì)菌的DGGE 圖譜 Fig.2 DGGE map of the bacteria in different Morchella colonies

2.3 DGGE 條帶的多樣性指數(shù)、豐度、均勻度和辛普森指數(shù)

用DGGE 圖譜對樣地細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)(H)、豐度(S)、均勻度(EH)和辛普森指數(shù)(Si)進(jìn)行比較分析，結(jié)果(表2)表明各樣品的多樣性指數(shù)、豐度、均勻度和辛普森指數(shù)都存在一定的差異。羊肚菌菌塘土中細(xì)菌豐度明顯高于對照樣品，同一樣本的上下層土樣相比較，上層的均勻度明顯高于下層。

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性

對10份樣本DGGE圖譜條帶的相似性進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)條帶相似性最高的是3A與3B，相似度達(dá)到63.2%，其次為2B與3B，相似度達(dá)59.3%(表3)。上層土壤與上層土壤的相似性高，下層土壤與下層土壤的相似性高。菌塘土與菌塘土、菌塘土與非菌塘土之間均沒有明顯差異。

表2 供試樣品DGGE 條帶的多樣性指數(shù)、豐度、均勻度和辛普森指數(shù) Table 2 Shannon–weaver index (H), Richness (S), Evenness (EH) and Simpson index (Si) of DGGE from the tested samples

表3 不同樣品細(xì)菌群落的相關(guān)系數(shù) Table 3 Correlation coefficients of bacteria community from different samples

2.5 主成分的方差貢獻(xiàn)率

在土壤細(xì)菌多樣性分析與群落結(jié)構(gòu)相似性分析的基礎(chǔ)上，對各樣品獲得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。第1主成分特征值的貢獻(xiàn)率總和為98.8%，第2主成份的為1.2%，所以本文中選取2個(gè)主成分來進(jìn)行分析(圖3)。非菌塘土(編號5A、5B)與其余樣品有較大的距離，說明微生物群落結(jié)構(gòu)有一定的差異。整體來看，上層土壤具有較高的第1主成分得分，而下層土壤具有較高的第2主成分得分。非菌塘上層土樣(5A)具有最高的第1、第2主成分得分。

圖3 主成分的方差貢獻(xiàn)率 Fig.3 Variance contribution ratio from PCA

2.6 菌塘土壤細(xì)菌的克隆條帶

將DGGE圖譜中12個(gè)優(yōu)勢條帶進(jìn)行回收、克隆、測序，然后與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)所有樣品序列與GenBank中序列的相似性都在97%以上。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，12條序列隸屬于Gammaproteobacteria、Myxococcaceae、Rhodospiri- llaceae、Acidobacteriaceae、Bacillaceae、Thermospo- rotrichaceae等6科(圖4)。

圖4 PCR–DGGE 條帶的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.4 Phylogenic tree from cloned DGGE bands

3 討論與結(jié)論

微酸或微堿的土壤(pH6.8～8.5)適宜羊肚菌發(fā)生[19–20]。本研究中樣地土壤呈微堿性(pH為6.67)。樣地為陡坡。陡坡的降水流失快，土壤容易被雨水帶走，所以，陡坡土層薄而貧瘠，水分也較少[21]，這種不利的刺激促使羊肚菌發(fā)生。樣地土壤堿解氮含量高，為多種微生物的發(fā)生提供了比較優(yōu)良的條件[22]。本研究結(jié)果顯示，較為豐富的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有利于羊肚菌的發(fā)生，這暗示了羊肚菌發(fā)生時(shí)需要某些微生物的刺激，或者需要土壤中某些特殊物質(zhì)的作用，而這些特殊物質(zhì)又與土壤中微生物活動有關(guān)，其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。羊肚菌發(fā)生地菌塘土和非菌塘土在細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)與多樣性方面均存在一定的差異。在測試樣本中，菌塘土具有較高的香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)、豐富度指數(shù)和較低的辛普森指數(shù)，這可能是由羊肚菌在生活史周期中向土壤環(huán)境中釋放代謝產(chǎn)物造成的。代謝產(chǎn)物中很多低分子量的化合物可作為化感物質(zhì)影響植物根際土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)。這種微生物群落結(jié)構(gòu)的變化又會反作用于羊肚菌，影響羊肚菌的發(fā)生。

從細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性來看，本研究中菌塘土與菌塘土、菌塘土與非菌塘土之間相似性的差異不大，說明菌塘土中尚未形成高度適應(yīng)羊肚菌發(fā)生的土著微生物，即便是菌塘土也不會支持羊肚菌持續(xù)發(fā)生[23–24]。

就羊肚菌菌塘土而言，上層土壤較下層土壤有更高的多樣性與豐富度。因?yàn)楸韺油林械挠袡C(jī)質(zhì)含量較高，所以在有機(jī)質(zhì)豐富的表層土壤中，微生物的數(shù)量多于養(yǎng)分較為貧瘠的下層。此外，土壤的通氣性差也是產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因，下層土壤緊實(shí)，通氣性差，不能提供給微生物良好的生存和繁殖空間，許多好氣性的微生物不能生存和繁殖，因此土壤微生物的數(shù)量大大減少。采樣時(shí)觀察到，自然狀態(tài)下羊肚菌菌絲延展的范圍有限，直徑未見超過30 cm 的情況，菌絲深度也沒有超過10 cm 的。羊肚菌對于有機(jī)質(zhì)、氧氣都有一定的依賴，對于周圍環(huán)境的影響有限。羊肚菌自然發(fā)生一般是單生或小范圍的叢生，即便在相似的自然環(huán)境下，也很難發(fā)現(xiàn)較為均勻且廣泛的分布。

本研究中從菌塘土樣本中分離到的Thermo- sporotrichaceae、Myxococcaceae 和Rhodospirillaceae 3 科細(xì)菌，作為菌塘土的優(yōu)勢種群，很有可能是利于羊肚菌發(fā)生的細(xì)菌。酸桿菌科Acidobacteriaceae作為優(yōu)勢種群在樣地所有樣本中均有分布。在自然狀態(tài)下，羊肚菌對于土壤有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，能否發(fā)生的先導(dǎo)因素是土壤中是否存在菌核，而細(xì)菌等微生物因素所起的作用只是刺激菌核萌發(fā)形成子實(shí)體。菌塘土中某些細(xì)菌可能會對羊肚菌子實(shí)體的形成產(chǎn)生影響，但不會是決定因素。相反，在人工栽培羊肚菌過程中，通過菌種制備和撒播覆土，能夠保證土壤中存在大量的菌核。栽培成功與否的關(guān)鍵是找到刺激菌核萌發(fā)的微生物因素。顯然，在人工栽培過程中，微生物因素居于更重要的地位，有更大的研究價(jià)值。

在羊肚菌生活史周期中，周圍土壤微生物會起何種作用，而羊肚菌內(nèi)生菌又會造成什么影響，現(xiàn)在都還沒有定論。借助PCR–DGGE 方法僅能作出粗略的推論，更為系統(tǒng)、準(zhǔn)確的研究還需要借助高通量測序等更先進(jìn)的試驗(yàn)方法。

[1] 楊芳，王新風(fēng)，李剛，等．不同碳、氮源對羊肚菌生長與胞內(nèi)多糖的影響[J]．食品科學(xué)，2007，28(11)：396–400．

[2] Ower R D．Notes on the development of the morel ascocarp：Morchella esculenta[J]．Mycologia，1982，74(1)：142–144．

[3] 劉作喜，王永吉．羊肚菌栽培新技術(shù)與深層發(fā)酵技術(shù)[J]. 中國野生植物資源，1996(4)：29–33．

[4] Ower R D，Mill G．Cultivation of Morchella：United States，US4866878(A)[P]．1986–06–17．

[5] Miller S C．Cultivation of Morchella[J]．US Patent，2005(6)：907–912．

[6] 趙琪，徐中志，程遠(yuǎn)輝，等．尖頂羊肚菌仿生栽培技術(shù)[J]．西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，22(6)：1690–1693．

[7] 朱斗錫．羊肚菌人工栽培研究進(jìn)展[J]．中國食用菌，2008，27(4)：3–5．

[8] Muyzer G，Waal E C D，Uitterlinden A G，et al．Profiling of complex microbial populations by denaturinggradientgel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplifiedgenes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology，1993，59：695–700．

[9] Li X，Penttinen P，Gu Y，et al．Diversity of nifHgene in rhizosphere and non-rhizosphere soil of tobacco in Panzhihua，China[J]．Annals of Microbiology，2012，62(3)：995–1001．

[10] Zhao Y G，Chen M，Bai J，et al．Response of microbial community to petroleum stress and phosphate dosage in sediments of Jiaozhou Bay，China[J]．Journal of Ocean University of China，2014，13(2)：249–256．

[11] Suresh K D，Alpana S，Takeshi W，et al．Methane production potential and methanogenic archaeal community structure in tropical irrigated Indian paddy soils[J]．Boology and Fertiltity of Soils，2014，50(2)：369–379．

[12] Nahid O，Carmen M G，F(xiàn)ernando M C，et al．Diversity and distribution of Halomonas in Rambla Salada，a hypersaline environment in the southeast of Spain[J]．FEMS Microbiology Ecology，2014，87(2)：460–474．

[13] 熊亞，陳強(qiáng)，唐玉明，等．瀘州老窖不同窖齡窖泥中乳酸菌多樣性PCR–DGGE 分析[J]．應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2013，19(6)：1020–1024．

[14] 孟珍貴，李永，趙琪，等．滇西北松口蘑菌塘的生態(tài)因子調(diào)查[J]．食用菌學(xué)報(bào)，2011，18(1)：12–17．

[15] 鮑士旦．土壤農(nóng)化分析[M]．3 版．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000：34–35，81–83，106–107．

[16] 邵蕾，王麗霞，張民，等．控釋肥類型及氮素水平對氮磷鉀利用率的影響[J]．水土保持學(xué)報(bào)，2009，23(4)：170–175．

[17] Yu Z T，Mark M．Comparisons of different hypervariable regions of rrsgenes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR–Denaturing Gradient Gel Electrop- horesis[J]. Applied and Environmental Microbiology，2004，70(8)：4800–4806．

[18] Saikaly P E，Stroot P G，Oerther D B．Use of 16S rRNAgene terminal restriction fragment analysis to assess the impact of solids retention time on the bacterial diversity of activated sludge[J]．Applied and Environmental Microbiology，2005，71(10)：5814–5822．

[19] Jaccard P．Etude comparative de la distribution florale dans une portion des Alpes et des Jura[J]．Bulletin de la Société vaudoise des Sciences Naturelles，1901，37：547–579．

[20] 王尚榮，劉高峰，趙貴紅．菏澤黃河沖積平原羊肚菌資源及生態(tài)環(huán)境調(diào)查[J]．中國食用菌，2008，27(6)：12–14．

[21] 武冬梅，謝宗銘，李全勝，等．新疆伊犁野生羊肚菌種質(zhì)資源調(diào)查及生境分析[J]．中國食用菌，2013，32(3)：12–14．

[22] 張君城，宋育紅，黃暉等．福建三明地區(qū)石杉科(Huperziaceae)植物群落特征及其生境調(diào)查分析[J]．復(fù)旦大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2008，47(5)：627–632．

[23] Liljeroth E，B??th E，Mathiasson I，et al．Root exudation and rhizoplane bacterial abundance of barley (Hordeum vulgare L.) in relation to nitrogen fertilization and rootgrowth[J]．Plant and Soil，1990，127(1)：81–89．

[24] Goldway M，Amir R，Goldberg D，et al．Morchella conica exhibiting a long fruiting season[J]．Mycological Research，2000，104(8)：1000–1004．