韓敏

(西安文理學(xué)院 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，陜西 西安 710065)

葉綠素是廣泛存在于綠色植物體中的一種重要的天然食用色素，它不但可以作為食品、化妝品的著色劑、脫臭劑等，還具有一定的保健功能，如可治療多種疾?。?-2］。在高等植物中含有葉綠素a(C55H72O5N4Mg)和葉綠素b(C55H70O6N4Mg)兩種Chl-a:Chl-b≈3∶1［3-4］。葉綠素是脂溶性色素，不溶于水，可溶于丙酮、乙醇和石油醚等有機(jī)溶劑，在顏色上，葉綠素a 呈藍(lán)綠色，葉綠素b 呈黃綠色，葉綠素a 和葉綠素b 的分子結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

根據(jù)目前的研究進(jìn)展，葉綠素的提取方法主要有以下幾種:丙酮研磨法、抽濾法、有機(jī)溶劑浸泡法、微波輔助提取法。本文采用超聲波輔助提取法對(duì)葉綠素提取工藝參數(shù)進(jìn)行研究，超聲波提取法具有提取效率高、提取時(shí)間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、提取工藝運(yùn)行成本低，綜合經(jīng)濟(jì)效益顯著;操作簡(jiǎn)單易行，設(shè)備維護(hù)、保養(yǎng)方便等特點(diǎn)［5］。它不僅能將葉片細(xì)胞組織破壁或變形，而且可做低溫處理降低葉綠素的降解。

圖1 葉綠素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of chlorophyll

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

蠶沙:陜西安康旬陽;95%乙醇，化學(xué)純。

7230G 型可見分光光度計(jì);HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋;DZF-6050 型真空干燥箱;SC-Ⅲ多頻聲化學(xué)發(fā)生器。

1.2 提取工藝

蠶沙中葉綠素的提取工藝如下:

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葉綠素含量的測(cè)定 準(zhǔn)確吸取0.5 mL 超聲后的上層清液，用95%乙醇溶液定容至50 mL，分別測(cè)定649，665 nm 處的吸光度。按如下公式計(jì)算葉綠素含量［6］:

葉綠素a 濃度Ca= 13.95A665－6.88A649，mg/L

葉綠素b 濃度Cb= 24.96A649－7.32A665，mg/L

葉綠素總濃度Ct= 18.08A649+6.63A665，mg/L

葉綠素含量=Ct×提取液體積×稀釋倍數(shù)/樣品質(zhì)量，mg/g。

式中，A665表示其在665 nm 處的吸光度，A649表示其在649 nm 處的吸光度。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以不同的超聲頻率、乙醇濃度、時(shí)間、料液比、提取次數(shù)為單因素，考察各因素對(duì)超聲提取的影響。

1.3.3 最佳組合實(shí)驗(yàn)條件的確定 本實(shí)驗(yàn)從經(jīng)濟(jì)、

實(shí)用、安全的原則，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，主要選取料液比、提取時(shí)間、乙醇濃度3 因素3 水平，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以葉綠素含量進(jìn)行分析比較，選擇最佳組合實(shí)驗(yàn)條件。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1 超聲頻率對(duì)葉綠素提取的影響

表2 超聲頻率對(duì)葉綠素提取的影響Table 2 The influence of ultrasonic frequency for extracting chlorophyll

準(zhǔn)確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，用9 mL 95%的乙醇為提取劑，在頻率為14，25，35 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)649，665 nm 處測(cè)其吸光度，計(jì)算葉綠素含量，選擇合適的頻率。

由表2 可知，超聲頻率為25 kHz 時(shí)，葉綠素的提取率最大，因而超聲頻率選25 kHz。

2.2 乙醇濃度對(duì)葉綠素提取的影響

準(zhǔn)確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，分別用9 mL不同濃度的乙醇為提取劑，在25 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)649，665 nm 測(cè)其吸光度，計(jì)算葉綠素含量，選擇合適的乙醇濃度。

圖2 乙醇濃度對(duì)葉綠素提取的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration of chlorophyll extract

由圖2 可知，乙醇濃度越大對(duì)提取越有利。綜合提取率與經(jīng)濟(jì)效益考慮，選取95% 的乙醇為最佳。

2.3 料液比對(duì)葉綠素提取的影響

準(zhǔn)確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，分別用5，7，9，10，12 mL 的95%乙醇為提取劑，在25 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)649，665 nm測(cè)其吸光度，計(jì)算葉綠素含量，選擇合適的料液比。

圖3 料液比對(duì)葉綠素提取的影響Fig.3 The influence of material liquid ratio on chlorophyll extract

由圖3 可知，料液比越大提取率越高。在1∶10(g/mL)之前，料液比對(duì)提取率的影響明顯大于其之后，為了節(jié)約試劑考慮，料液比選擇1∶10(g/mL)。

2.4 時(shí)間對(duì)葉綠素提取的影響

準(zhǔn)確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，用95%的乙醇10 mL 為提取劑，在25 kHz 下分別超聲10，20，30，40，50，60 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)649，665 nm 測(cè)其吸光度，計(jì)算葉綠素含量，選擇合適的超聲時(shí)間。

圖4 時(shí)間對(duì)葉綠素提取的影響Fig.4 The influence of time for extracting chlorophyll

由圖4 可知，提取率隨時(shí)間的增加而增大。但在40 min 之后，曲線趨于平緩，如果繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，會(huì)增加能源消耗，所以40 min 是一個(gè)比較合適的操作條件。

2.5 提取次數(shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取干燥的蠶沙粉末1.00 g，分別用10 mL的95%乙醇為提取劑，在25 kHz 下超聲40 min;吸取上層清液0.5 mL，用50 mL 容量瓶定容;然后再用紫外分光光度儀在波長(zhǎng)649，665 nm 測(cè)其吸光度，計(jì)算葉綠素含量;然后離心分離，取濾渣，重復(fù)之前操作，選擇合適的超聲次數(shù)。

圖5 提取次數(shù)對(duì)葉綠素提取的影響Fig.5 The influence of the number for extracting chlorophyll

由圖5 可知，物料中的葉綠素隨著提取次數(shù)的增大而減少，在提取3 次之后葉綠素含量保持不變且很低。因而綜合考慮，提取3 次就能基本將其中的葉綠素提取出來，且相對(duì)而言節(jié)約成本。

3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，綜合考慮主要因素對(duì)葉綠素提取率的影響，進(jìn)行L9(3)3正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 The orthogonal experiment results

由表3 可知，最優(yōu)組合為A3B3C3，即以1 ∶12(g/mL)為料液比，用100%的乙醇在25 kHz 下超聲50 min 為最優(yōu)提取條件。但是為了節(jié)約成本考慮乙醇濃度選90%。且由各因素的極差關(guān)系R2＞R1＞R3可知，超聲時(shí)間是影響葉綠素提取的主要因素，其次是料液比，乙醇濃度對(duì)葉綠素提取的影響最小。

4 結(jié)論

將單因素實(shí)驗(yàn)與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)從蠶沙中超聲提取葉綠素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況，獲得最佳提取工藝為:用90%乙醇作提取劑，干燥的蠶沙葉與提取劑的用量比為1∶12(g/mL)，在25 kHz 下超聲50 min，提取次數(shù)為3 次。

［1］ 王順民，牛彬.萵筍葉葉綠素的提取工藝研究［J］. 安徽工程科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22(4):14-17.

［2］ 汪坤，洪海，金文英，等. 微波輔助提取蠶沙中葉綠素的工藝研究［J］. 食品科學(xué)，2009，30(6):76-79.

［3］ 史銀飛，嚴(yán)桂琴，李一平.蠶沙葉綠素的提取工藝研究［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2009，30(4):72-74.

［4］ 李祥，種亞莉，曹江絨，等. 微波協(xié)同超聲輔助提取蠶沙葉綠素的工藝研究［J］. 日用化學(xué)工業(yè)，2013，43(4):285-289.

［5］ 房媛.葡萄糖醛酸內(nèi)酯清潔生產(chǎn)［D］.咸陽:陜西科技大學(xué)，2013.

［6］ 李合生.植物生理生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2009.