付春華，董平軒，顧相伶，孫漢文，宋新峰，張彥聰

(1.德州學(xué)院 醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023;2.山東省新型藥用輔料及緩控釋制劑工程實(shí)驗(yàn)室，山東 德州 253023)

超順磁性四氧化三鐵納米粒子具有顯著的磁學(xué)性能、較低的生物毒性以及良好的生物相容性，這些特點(diǎn)使其在藥物磁靶向傳輸和釋放、核磁共振成像、腫瘤熱療、生物傳感器與生物探針及酶工程載體等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景［1-3］。同時(shí)，生物體內(nèi)的巨噬細(xì)胞和網(wǎng)狀細(xì)胞很容易識(shí)別IONP，作為轉(zhuǎn)基因載體IONP 可顯著提高基因轉(zhuǎn)染效率［4-5］。但是通過(guò)物理、化學(xué)方法獲得的IONP 粒子在應(yīng)用時(shí)存在以下不足:首先，裸磁性粒子在水中分散性差、易聚集沉降，需要表面修飾提高其穩(wěn)定性;其次，IONP 表面缺乏可利用活性基團(tuán)［6-8］，不易在其表面引入生物活性分子。利用聚合物對(duì)IONP 進(jìn)行包覆是解決上述問(wèn)題最有效的途徑之一。利用高分子本身的特性賦予IONP 良好的生物相容性、分散性及特殊應(yīng)用目的，我們課題組在前期對(duì)IONP 改性、生物學(xué)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上［9-12］，用樹(shù)枝狀高分子PAMAM對(duì)IONP 進(jìn)行接枝，并對(duì)不同基團(tuán)封端的復(fù)合粒子的細(xì)胞毒性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、甲醇、甲苯、乙二胺(en)、丙烯酸甲酯(MA)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilan，APTS)均為分析純;細(xì)胞株HepG2，購(gòu)自北京生化研究所;CCK-8 試劑盒，購(gòu)自Yeasen 公司。

Zetasizer Nano ZS 馬爾文粒度儀;Spectrum GX紅外光譜儀;SEM-EDS 掃描電鏡-能譜儀;MERLIN Compact 掃描電鏡;布魯克X 射線能譜儀EDS;731型可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 IONP 的制備

將FeCl3·6H2O 和FeSO4·7H2O 按物質(zhì)的量之比2∶1 的比例溶解于去離子水，高速攪拌下加入一定量氨水，共沉淀獲得超順磁性、表面帶有羥基的IONP。

1.3 PAMAM-IONP 復(fù)合粒子的制備

參照文獻(xiàn)［12］的工藝路線，IONP 分散于甲苯溶液中超聲30 min 后加入APTS，120 ℃回流反應(yīng)，得到表面氨基化的粒子NH2-IONP(G0)。利用G0表面的氨基與丙烯酸甲酯(MA)在低溫下進(jìn)行邁克爾加成反應(yīng)后磁分離，獲得G0.5 的IONP 粒子。G0.5粒子與過(guò)量乙二胺氨解后磁分離獲得G1. 0 代粒子。重復(fù)邁克爾加成和胺解反應(yīng)，獲得所需代數(shù)的PAMAM-IONP 復(fù)合粒子。通過(guò)控制反應(yīng)步驟，得到表面為酯鍵封端和氨基封端不同的粒子。

1.4 可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量復(fù)合粒子中聚合物的含量

實(shí)驗(yàn)原理是Fe2+與鄰二氮菲在pH 為3 ～9 的條件下生成橘紅色絡(luò)合物，該橘紅色絡(luò)合物最大吸收波長(zhǎng)為510 nm，可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量［13］。按一定濃度梯度稱量IONP 置于容量瓶中，加入鹽酸超聲波處理將粒子中的鐵元素轉(zhuǎn)化為Fe3+和Fe2+。然后加入過(guò)量鹽酸羥胺將Fe3+轉(zhuǎn)還原為Fe2+后調(diào)節(jié)pH 值，加入過(guò)量鄰二氮菲反應(yīng)規(guī)定時(shí)間后，測(cè)量得到吸光度與Fe3O4濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。用同樣方法處理接枝G5.0 代的復(fù)合粒子后測(cè)定吸光度，從而間接計(jì)算PAMAM 聚合物的質(zhì)量含量。

1.5 材料細(xì)胞毒性試驗(yàn)——MTT 法

實(shí)驗(yàn)用納米粒子經(jīng)低溫間歇滅菌法(60 ℃、10 h，37 ℃、12 h，連續(xù)3 次)，并用無(wú)菌水溶液多次洗滌后，按照不同濃度加入細(xì)胞培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)期的HepG2 細(xì)胞在IONP 種類和含量不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用CCK-8 試劑盒在免疫酶標(biāo)儀(Multiskan MK3353，USA)上測(cè)定492 nm 處的吸光度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR)，從而判斷粒子的細(xì)胞毒性。

2 結(jié)果與討論

2.1 IONP 及PAMAM-IONP 復(fù)合粒子的特征

使用1.2 節(jié)所述共沉淀法制得的IONP 粒子，通過(guò)掃描電鏡觀察，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 IONP 的掃描電鏡圖Fig.1 SEM spectra of IONP

由圖1 可知，粒子大小分布均勻、表面相對(duì)圓整，直徑在10 ～20 nm 之間，符合后期應(yīng)用對(duì)粒子尺寸的要求。少量粒子有團(tuán)聚現(xiàn)象，使用前超聲波處理可得單分散的磁性粒子。

IONP 與PAMAM-IONP 的掃描電鏡-能譜(SEMEDS)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 IONP(1)與PAMAM-IONP(4，G5.0)EDS 圖譜Fig.2 EDS spectra of IONP (1)and PAMAM-IONP(4，G5.0)

圖2 顯示，修飾前后，粒子中Fe、O、C 以及Si 等元素的含量有明顯變化。其中，F(xiàn)e 元素所占質(zhì)量百分比降低，而O、C 以及Si 等元素的質(zhì)量百分比增加。為更加清晰的了解這一變化趨勢(shì)，將各元素相應(yīng)的含量計(jì)算并列于表1 中。表中數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，隨著修飾代數(shù)的增加，C 元素的含量逐漸增加。該結(jié)果初步表明:PAMAM 成功的接枝IONP，獲得目標(biāo)產(chǎn)物復(fù)合粒子。

此外，表1 中也給出了所得粒子的水相粒徑和電位結(jié)果。與SEM 觀察所得粒徑不同，馬爾文粒度儀測(cè)試IONP 粒徑結(jié)果為696.2 nm。究其原因，我們認(rèn)為，由于裸IONP 粒子在水溶液中穩(wěn)定性差、易聚沉，因此采用激光散射測(cè)試粒徑出現(xiàn)了較大誤差。粒子接枝修飾后，由于在水溶液中穩(wěn)定性增強(qiáng)、分散性得以改善，馬爾文粒度儀測(cè)試亦較為真實(shí)的反映了其粒徑。從粒子電位的測(cè)試結(jié)果來(lái)看，使用PAMAM 對(duì)IONP 表面修飾后，其電位從－ 4. 28 mV 變化 為－23.30 mV，證明修飾后的粒子得以在水相穩(wěn)定性增強(qiáng)，進(jìn)一步證明PAMAM 成功的接枝IONP。

表1 不同粒子的粒徑、電位及EDS 元素檢測(cè)結(jié)果Table 1 The test data of particle size，potential and element content

2.2 紅外檢測(cè)結(jié)果

使用紅外光譜儀對(duì)不同粒子進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同粒子的紅外圖譜Fig.3 FTIR spectra of different particles

由圖3 可知，與裸磁粒子的紅外譜圖相比，APTS 氨 基 化 的 IONP 和 PAMAM-IONP 在3 400 cm－1附近出現(xiàn)顯著的吸收，對(duì)應(yīng)于N—H 特征吸收峰，2 800 ～2 900 cm－1處的吸收對(duì)應(yīng)于C—H的特征吸收峰。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，使用1.3 節(jié)所述方法可成功制備PAMAM-IONP 復(fù)合粒子。

2.3 殼層聚合物質(zhì)量含量測(cè)試結(jié)果

為進(jìn)一步了解IONP 表面包覆的PAMAM 含量，用分光光度法測(cè)試了不同粒子的吸光度。IONP 粒子濃度與吸光度A 的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖4。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)達(dá)到了0.991，該曲線可用于粒子濃度的標(biāo)定。相關(guān)測(cè)試結(jié)果表明，接枝5.0 代的PAMAM-IONP 外層聚合物的平均質(zhì)量含量為(13.6 ±0.3)%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較好，復(fù)合定量測(cè)定要求。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將裸IONP、氨基封端復(fù)合粒子(PAMAM-IONP，G5. 0)和 酯 鍵 封 端 的 粒 子(MA-PAMAM-IONP，G5.5)分別以5，10，50，100，200，500 μg/mL 濃度梯度的培養(yǎng)液與HepG2 細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 Fe3O4粒子濃度與吸光度A 的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of Fe3O4 concentration and absorption

圖5 不同類型、不同濃度的粒子對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of different particles on HepG2 cell proliferation

由圖5 可知，同一種磁性粒子的濃度低于200 μg/mL時(shí)，濃度對(duì)細(xì)胞的增殖性影響沒(méi)有明顯差異，但是當(dāng)粒子濃度高至500 μg/mL 時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制性明顯增加。比較3 種粒子對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，濃度相同時(shí)，裸SIONP 細(xì)胞增殖數(shù)最小，而氨基封端的復(fù)合粒子細(xì)胞增殖數(shù)最高，表明氨基端的粒子細(xì)胞毒性最小，細(xì)胞安全性最佳，上述結(jié)果與文獻(xiàn)［14］報(bào)道一致，實(shí)現(xiàn)了材料表面改性修飾的目的。

3 結(jié)論

目前IONP 的應(yīng)用主要集中在生命科學(xué)領(lǐng)域，因此對(duì)其修飾改性材料的生物安全性評(píng)價(jià)是能否進(jìn)行后期研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)是生物安全評(píng)價(jià)的重要組成部分。本研究結(jié)果表明，采用樹(shù)枝狀高分子PAMAM 修飾的IONP 不僅改善了粒子在水溶液中的分散性和穩(wěn)定性，其細(xì)胞毒性也有明顯下降，且細(xì)胞毒性與粒子表面的基團(tuán)的種類有關(guān)。因此后期根據(jù)不同的用途設(shè)計(jì)合理的分子結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)。

［1］ Jeong U，Teng X W，Wang Y，et al. Magnetic nanoparticles:preparation，physical properties，and applications in biomedicine［J］.Advance Materials，2007，19:33-60.

［2］ Weinstein J S，Varallyay C G，Dosa E，et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles:diagnostic magnetic resonance imaging and potential therapeutic applications in neurooncology and central nervous system inflammatory pathologies［J］.Journal of Cerebral Blood Flow ＆ Metabolism，2010，30:15-35.

［3］ Nakai G，Matsuki M，Harada T，et al.Evaluation of axillary lymph nodes by diffusion-weighted MRI using ultrasmall superparamagnetic iron oxide in patients with breast cancer:Initial clinical experience［J］.Journal of Magnetic Resonance Imaging，2010，30:15-35.

［4］ Pankhurst Q A，Connolly J，Jones S K，et al.Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine［J］. Journal of Physics D:Applied Physics，2003，36:167-181.

［5］ Akbarzadeh A，Samiei M，Davaran S.Magnetic nanoparticles:preparation，physical properties，and applications in biomedicine［J］. Nanoscale Research Letters，2012，7:144-152.

［6］ Issa B，Obaidat I M，Albiss B A，et al.Magnetic nanoparticles:surface effects and properties related to biomedicine applications［J］. International Journal of Molecular Sciences，2013，14:21266-21305.

［7］ Kostiantyn Turcheniuk，Arkadii V Tarasevych，Valeriy P Kukhar，et al.Recent advances in surface chemistry strategies for the fabrication of functional iron oxide based magnetic nanoparticles ［J］. Nanoscale，2013，5:10729-10752.

［8］ Ruiz A，Morais P C，Azevedo R B，et al.Magnetic nanoparticles coated with dimercaptosuccinic acid:development，characterization，and application in biomedicine［J］. Journal Nanoparticals Research，2014，16:2589-2608.

［9］ Sun H W，Zhu X J，Zhang L Y，et al.PDEA-coated magnetic nanoparticles for gene delivery to Hep G2 cells［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2013，18:648-654.

［10］孫漢文，張連營(yíng)，朱新軍，等.PEGMA 磁性納米凝膠的光化學(xué)原位合成、表征及載藥性能研究［J］.中國(guó)科學(xué)(B 輯:化學(xué))，2008，11:999-1005.

［11］孟繁宗，孫漢文，張連營(yíng)，等. 熒光磁性微球Fe3O4@PMAA-Dy 的制備和表征［J］. 材料導(dǎo)報(bào)，2009(6):133-136.

［12］Wang J Z，Zhao G H，Li Y F.Reversible immobilization of glucoamylase onto magnetic chitosan nanocarriers［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013(97):681-692.

［13］Zhang C，Jiang M G，Huang W，et al. Determination of iron ions in cooling water by spectrophotometry［J］. Journal of Salt and Chemical Industry，2013(11):45-47.

［14］Rasala R M，Janorkarc A V，Hirta D E.Poly(lactic acid)modifications［J］. Progress in Polymer Science，2010(35):338-356.