吳文欣，李 維

（1.湖南省第二人民醫(yī)院，長沙410000；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長沙410000）

人成骨肉瘤MG63紫杉醇耐藥細(xì)胞系建立及生物學(xué)特性研究

吳文欣1，李 維2

（1.湖南省第二人民醫(yī)院，長沙410000；2.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南長沙410000）

目的 建立紫杉醇（Taxol）誘導(dǎo)的人成骨肉瘤MG63耐藥細(xì)胞株亞系MG63/Taxol，并觀察其生物學(xué)特性。方法 以Taxol為誘導(dǎo)劑，采用大劑量沖擊與小劑量維持相結(jié)合的方法誘導(dǎo)MG63細(xì)胞，建立耐藥細(xì)胞株亞系MG63/Taxol；集落形成實(shí)驗(yàn)檢測藥物敏感性；光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。結(jié)果 （1）經(jīng)過6個(gè)月的誘導(dǎo)，建立了MG63/Taxol細(xì)胞株亞系。（2）MG63/Taxol對Taxol的耐藥指數(shù)為9.50，對順鉑、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶（5-Fu）也產(chǎn)生不同程度交叉耐藥。（3）光鏡觀察可見MG63細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)呈梭形，大小一致；MG63/Taxol細(xì)胞株亞系排列不規(guī)則，大小不均，形態(tài)呈三角形、多角形及多核現(xiàn)象。（4）細(xì)胞生長曲線顯示MG63/Taxol細(xì)胞較親本細(xì)胞生長緩慢。（5）細(xì)胞周期分析顯示，MG63/Taxol細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞分布增多，S期細(xì)胞分布減少。結(jié)論 （1）采用大劑量沖擊與小劑量維持相結(jié)合的方法誘導(dǎo)建立的人成骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/Taxol細(xì)胞對順鉑、甲氨蝶呤、5-Fu產(chǎn)生不同程度交叉耐藥。（2）MG63/Taxol細(xì)胞株亞系細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞周期分布與母系細(xì)胞MG63有顯著差異。

骨肉瘤；細(xì)胞系；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；藥物耐受性；紫杉醇；耐藥細(xì)胞

骨肉瘤是一種好發(fā)于長骨干骺端的惡性腫瘤。1986年Rosen[1]提出新輔助化療治療骨肉瘤，隨著新輔助化療的廣泛應(yīng)用，骨肉瘤的5年生存率已達(dá)60%以上，但惡性腫瘤化療后多藥耐藥的產(chǎn)生仍是影響腫瘤患者化療療效和預(yù)后的主要因素之一。本研究以人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63為誘導(dǎo)對象，采用大劑量沖擊與小劑量維持相結(jié)合的方法誘導(dǎo)建立了人成骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/紫杉醇（Taxol），并分析其生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料 人成骨肉瘤細(xì)胞株MG63由中南大學(xué)湘雅醫(yī)院惠贈(zèng)。Taxol（北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司）、順鉑（山東齊魯制藥廠）、甲氨蝶呤（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、5-氟尿嘧啶（5-Fu，天津金耀氨基酸有限公司）、小牛血清（Gibco）、胰蛋白酶（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 方法

1.2.1 MG63培養(yǎng)與傳代 MG63在含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每天換液1次。3～5 d長至80%后傳代。

1.2.2 MG63多藥耐藥細(xì)胞株亞系的建立 采用大劑量沖擊與小劑量維持相結(jié)合的方法誘導(dǎo)MG63耐藥，取對數(shù)生長期MG63細(xì)胞接種至10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，Taxol初始濃度從10 ng/mL開始，藥物作用24 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入含0.5 ng/mL Taxol的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，待其恢復(fù)正常生長，消化傳代后復(fù)用10 ng/mL處理24 h，如此反復(fù)換液、傳代，逐步提高Taxol濃度間歇誘導(dǎo)，得到能耐受30 ng/mLTaxol濃度的細(xì)胞株，命名為MG63/Taxol[2]，并將其維持培養(yǎng)在含1 ng/mL Taxol的完全培養(yǎng)液中。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 采用倒置相差顯微鏡觀察對數(shù)生長期的MG63和MG63/Taxol細(xì)胞形態(tài)并照相。

1.2.4 細(xì)胞生長曲線測定 將濃度1×104mL-1的MG63和MG63/Taxol細(xì)胞分別接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，24 h后每天以MTT法測定每組光密度（OD）值，連續(xù)7 d，繪制生長曲線。

1.2.5 細(xì)胞多藥耐藥性檢測 將對數(shù)生長期的MG63和MG63/Taxol細(xì)胞以1×103mL-1細(xì)胞濃度接種于24孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后分別加入等體積不同濃度含Taxol、順鉑、甲氨蝶呤、5-Fu的培養(yǎng)液，每種藥物濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，定為藥物組；設(shè)無藥培養(yǎng)基換液的剩余3孔為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3周，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS小心浸洗2次，空氣干燥。甲醇固定15 min，棄甲醇后空氣干燥。用Giemsa染液染色10 min，流水緩慢洗去染液，空氣干燥，計(jì)算克隆形成數(shù)（克隆形成數(shù)與活細(xì)胞數(shù)成正比），取其平均值，計(jì)算不同濃度的藥物對腫瘤細(xì)胞的抑制率=（1-藥物組克隆數(shù)）/對照組克隆數(shù)×100%。采用對數(shù)計(jì)量直線回歸法計(jì)算出各種藥物對細(xì)胞達(dá) 50%抑制率時(shí)的藥物濃度（IC50，g/mL），并計(jì)算耐藥指數(shù)（RI）=IC50耐藥細(xì)胞/IC50親代細(xì)胞。Taxol誘導(dǎo)6個(gè)月，建立了人成骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/Taxol，用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞系對抗腫瘤藥物的耐藥程度變化，以IC50來衡量，

1.2.6 細(xì)胞周期 用0.25%胰酶（無EDTA）分別收集耐藥細(xì)胞誘導(dǎo)期間同步傳代的MG63和MG63/Taxol，用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，加入3 mL預(yù)冷（-20℃）70%乙醇到細(xì)胞沉淀中，于4℃固定過夜，離心收集細(xì)胞，以3mL的PBS洗細(xì)胞2次，加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化乙錠（PI），100 μg/mL核糖核酸酶A（RNase A），0.2%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100），4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)變化 光鏡下可見MG63和MG63/Taxol細(xì)胞均為貼壁生長，MG63排列較規(guī)則，形態(tài)近似梭形，有少量偽足，核仁清晰、大；MG63/Taxol細(xì)胞排列不規(guī)則，三角形、多角形多見，形態(tài)多樣，核仁清晰、大，可見多核現(xiàn)象。見圖1。

圖1 光鏡下MG63和MG63/Taxol細(xì)胞形態(tài)（200×）

2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性

MG63/Taxol對Taxol的RI為9.50，對順鉑、甲氨蝶呤、5-Fu也產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥，見表1。

表1 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞對化療藥物的敏感性

2.3 細(xì)胞生長與增殖 MG63細(xì)胞與其多藥耐藥細(xì)胞株亞系MG63/Taxol細(xì)胞生長曲線存在差異，MG63/Taxol較MG63生長緩慢，見圖2。

圖2 MG63及其耐藥細(xì)胞系MG63/Taxol生長曲線

2.4 MG63及其耐藥細(xì)胞系MG63/Taxol細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，MG63、MG63/Taxol細(xì)胞G0/G1、S期細(xì)胞分布比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2、圖3。

表2 MG63及其耐藥細(xì)胞系MG63/Taxol細(xì)胞周期分布（±s，%）

表2 MG63及其耐藥細(xì)胞系MG63/Taxol細(xì)胞周期分布（±s，%）

注：與MG63同期比較，aP＜0.05。

細(xì)胞MG63 MG63/Taxol G0/G1 G2/M S 49.49±0.58 53.29±1.01a13.97±0.58 13.13±0.57 36.54±0.57 33.57±0.61a

圖3 MG63及其耐藥細(xì)胞系MG63/Taxol細(xì)胞周期分布

3 討 論

惡性腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，化療后耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生往往導(dǎo)致原發(fā)灶的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，體外腫瘤多藥耐藥細(xì)胞亞系的建立是研究腫瘤多藥耐藥性的基礎(chǔ)[3-4]。同時(shí)也為臨床化療方案的優(yōu)化提供參考。本研究發(fā)現(xiàn)，人成骨肉瘤Taxol耐藥細(xì)胞MG63/Taxol對順鉑、甲氨蝶呤、5-Fu也產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥，對順鉑產(chǎn)生低度耐藥。該結(jié)果提示，2種藥物聯(lián)用治療腫瘤可以收到更好的效果，同時(shí)可以避免腫瘤多藥耐藥的產(chǎn)生[5]。本研究中構(gòu)建的骨肉瘤Taxol耐藥細(xì)胞MG63/Taxol其形態(tài)和結(jié)構(gòu)與親本細(xì)胞系相比具有明顯差異，這種形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變可能與耐藥產(chǎn)生相適應(yīng)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。細(xì)胞生長曲線結(jié)果顯示，骨肉瘤Taxol耐藥細(xì)胞MG63/Taxol耐藥細(xì)胞較親本細(xì)胞MG63生長緩慢，反映了耐藥細(xì)胞生長繁殖能力下降，倍增時(shí)間延長，這可能是由于細(xì)胞在長期藥物的刺激下，一些殘余的耐藥細(xì)胞處于休眠期（G0），因而導(dǎo)致細(xì)胞對藥物的敏感下降，同時(shí)增長繁殖能力下降，此現(xiàn)象可能和臨床化療中腫瘤耐藥后瘤體迅速增大、局部復(fù)發(fā)的現(xiàn)象有關(guān)。

骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與細(xì)胞周期異常調(diào)控密切相關(guān)[6-9]。本研究中應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測MG63細(xì)胞與其Taxol耐藥細(xì)胞MG63/Taxol的G0/G1、G2、M期及S期比例。結(jié)果顯示，G0/G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；研究證明，M、G1、G2期細(xì)胞對細(xì)胞周期非特異性藥物較敏感，而S期細(xì)胞對細(xì)胞周期特異性藥物敏感性最強(qiáng)，而G0期細(xì)胞，除周期非特異性藥物外，其他化療藥物對其作用不大。G0期細(xì)胞對化療藥物具有很大的耐藥性。反復(fù)經(jīng)化療藥物刺激后篩選的耐藥細(xì)胞對周期非特異性藥物顯示了低抵抗性，而對周期特異性化療藥如5-Fu和甲氨蝶呤產(chǎn)生了較高抵抗性。顯然，G0期細(xì)胞的存在及其增殖、分裂可能是導(dǎo)致骨肉瘤化療失敗及腫瘤細(xì)胞局部復(fù)發(fā)的主要原因之一[10]，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Study on establishment of paclitaxel resistant osteosarcoma cell line MG63/Taxol and its biological characteristics

Wu Wenxin1，Li Wei2
（1.Hunan Provincial Second People′s Hospital，Changsha 410000，China；2.Third Xiangya Hospital of Central South University，Changsha，Hunan 410000，China）

ObjectiveToestablish thepaclitaxel（Taxol0 induced osteosarcoma MG63 drug resistance cell subline（MG63/ Taxol）and to observe its biological characteristics.MethodsPaclitaxel resistant human osteosarcoma cell subline（MG63/Taxol）was established by adopting large dose impact combined with small dose maintenance to induce MG63 cell line with Taxol as the inducer.The sensitivity of chemotherapy drugs for the MG63 and MG63/Taxol cell sublines were measured by the colony formation assay.The cell morphology change was observed through light microscopy.The proliferation ability of cell lines was measured by growth curve.The cell stages were analyzed by flow cytometry.Results（1）Through 6-month induction，paclitaxel resistant osteosarcoma cell subline（MG63/Taxol）was established.（2）The resistant index of MG63/Taxol to Taxol was 10.55.MG63/ Taxol also produced the various degrees of cross resistance to cisplatin，methotrexate and 5-Fu.（3）The cell morphology was observed through light microscopy.The MG63/Taxol cells were regular arranging，spindle shape and size consistent，MG63/Taxol cell subline was irregular arranging，size inconsistent and morphology showed triangle shape，multiangular shape and multi-nucleation.（4）The cell growth cure showed that MG63/Taxol cells grew slowly than the parent cells.（5）The cell cyclical analysis displayed that the distribution of the G0/G1 stage cells was increased，while the S stage cells were decreased.Conclusion（1）A paclitaxel resistant human osteosarcoma cell subline（MG63/Taxol）established by adopting the large dose impact combined with small dose maintenance（MG63）generates the cross resistance to cisplatin，methotrexate and 5-Fu in different degrees.（2）MG63/Taxol cell sublineis significantlydifferent fromtheparent cell MG63intheaspects of cell morphology，cell growthcurveandcell cycledistribution.

Osteosarcoma；Cell line；Apoptosis；Cell proliferation；Drug tolerance；Paclitaxel；Resistant cells

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.15.004

A

1009-5519（2015）15-2259-03

2015-02-17）

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本刊編輯部

湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（11JJ3105）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013FJ3039）。

吳文欣（1980-），男，湖南衡東人，主治醫(yī)師，主要從事臨床脊柱外科工作；E-mail：wuwenxin@126.com。

李維（E-mail：lilywei1979@126.com）。