李 莉， 沈愛群， 陳姝彤， 陳科偉， 李懷芳， 歐陽一芹

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200065)

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·臨床研究·

上皮性卵巢癌患者化療前后血清uPA含量變化及其對預后的影響

李 莉， 沈愛群， 陳姝彤， 陳科偉， 李懷芳， 歐陽一芹

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200065)

目的 探討上皮性卵巢癌患者化療前及化療后血清中纖溶酶原激活劑(uPA)含量的變化與預后的相關(guān)性。方法 107例卵巢惡性腫瘤患者行手術(shù)初治后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測化療前及化療后血清中uPA的含量。102例相同年齡段的正常健康婦女作為對照。結(jié)果 卵巢癌患者化療前及化療后血清中uPA的含量均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。卵巢癌患者化療前血清中uPA的水平高于化療后，兩者的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。單因素生存分析中，化療前uPA水平、化療后uPA水平、FIGO分期、殘余瘤灶直徑大小和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響卵巢癌患者無進展生存期(progression-free survival, PFS)和總生存期(overall survival, OS)的相關(guān)因素(P<0.05)。Cox比例風險模型分析顯示，化療前uPA水平和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與預后明顯相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 卵巢癌患者化療前后血清中uPA水平高于正常人群，且其水平高低與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及殘存瘤灶大小高度相關(guān)?；熐把逯衭PA含量可作為評價患者PFS和OS的獨立預后因子。

上皮性卵巢癌； 纖溶酶原激活劑； 血清； 預后

卵巢上皮癌是婦科腫瘤中威脅婦女死亡的重要原因。由于其發(fā)生的隱匿性，僅有15%的早期卵巢惡性腫瘤可以被及時診斷[1]。大多數(shù)患者被診斷時都處于疾病的進展期，因此其生存率只有20%～25%[2]。惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導致腫瘤復發(fā)及患者死亡的主要原因，尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator, uPA)是降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)中最重要的蛋白酶水解類，其不僅能降解ECM和基底膜成分，還能通過細胞內(nèi)信號通路影響腫瘤的細胞增殖和血管生成過程。有研究認為uPA可能在卵巢癌的早期擴散中起重要作用。同時多篇報道[3-6]提示uPA含量的高低與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)。這說明uPA系統(tǒng)可望成為卵巢癌的一個新的標志物。本研究檢測行腫瘤細胞減滅術(shù)的上皮性卵巢癌患者在化療前及化療6療程后血清中uPA含量，探討其臨床病理等因素的關(guān)系及其是否能作為獨立的預后因子。

1 資料與方法

1.1 一般資料

血清標本均來自于2008年1月至2010年5月同濟大學附屬同濟醫(yī)院婦科卵巢癌住院患者,共107例，年齡40～69歲，平均年齡(55.3±7.3)歲。選取同期行婦科體檢的健康婦女共102名作為對照組，年齡40～68歲，平均年齡(54.4±6.6)歲。卵巢癌患者初治均直接采取腫瘤細胞減滅術(shù)且術(shù)前均未行新輔助化療，患者術(shù)后均接受紫杉醇和鉑類聯(lián)合化療，每隔3周1次，至少6次。所有上皮性卵巢癌患者的組織標本均由病理學檢查確診，其中漿液性癌89例，非漿液性癌18例(黏液性癌5例，透明細胞樣癌7例，子宮內(nèi)膜樣癌6例)；患者的臨床分期按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO,2006年)標準，107例中Ⅰ～Ⅱ期57例，Ⅲ～Ⅳ期50例；組織學分級： 高分化(G1)21例，中低分化(G2、G3)86例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移： 術(shù)后證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)32移例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例；殘余瘤灶直徑<1cm 61例，直徑≥1cm 46例。全部病例均隨訪至2013年12月，至隨訪截止日期，107例上皮性卵巢癌患者中53例死亡，54例生存。收集卵巢癌患者化療前及6次化療后的血清。對照組研究對象均無高血壓、糖尿病及肝腎功能疾病史，采血期間均排除服用避孕藥及激素類藥物，2周內(nèi)均未接受抗凝及溶栓治療。

1.2 標本收集

收集卵巢癌患者術(shù)后化療前、化療6個療程后以及健康婦女的空腹外周靜脈血4ml，標本注入干試管內(nèi)，4h內(nèi)在室溫下離心半徑3cm，3000r/min，離心10min，取上清液，-80℃保存待測。

1.3 血清UPA含量的檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法檢測血清中uPA的含量。uPA ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，所有操作按試劑盒說明書進行。酶聯(lián)儀為Bio-Rad 680購自美國Bio-Rad公司。

1.4 標準曲線的建立及結(jié)果判斷

以標準品uPA的濃度的作X軸,及其相應(yīng)的D450值作Y軸，在Excel工作表中繪制標準品線性回歸曲線，即Y=0.001X+0.115 R2=0.981。

1.5 統(tǒng)計學處理

用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析,均數(shù)比較采用t檢驗。生存分析中，用Kaplan-Meier法計算累計生存率并繪制生存曲線,Log-Rank法進行單因素分析，比較不同因素間無進展生存期(progression-free survival， PFS)和總生存期(overall survival， OS)的差異。采用Cox風險比例回歸模型進行影響PFS和OS的多因素分析。全部檢驗均為雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 化療前、后uPA含量的變化

卵巢癌患者化療前、化療6個療程后血清中uPA值與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)；化療6個療程后血清uPA含量較化療前明顯下降(P<0.001)，見表1。

表1 3組血清uPA含量比較Tab.1 Serum uPA levels among three groups (ng·ml-1)

2.2 化療前、后uPA含量與臨床病理等因素的關(guān)系

Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者化療前及化療6個療程后血清uPA含量明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.001)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者化療前、后血清uPA含量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.001，P<0.01)；殘余瘤灶直徑≥1cm患者化療前、后血清uPA含量均明顯高于殘留腫瘤直徑<1cm患者(P<0.001，P<0.01)；患者化療前、后血清uPA含量與病理類型、組織學分級均無明顯相關(guān)性(P均>0.05)，見表 2。

2.3 化療前、后血清uPA含量與預后的關(guān)系

2.3.1 單因素生存分析 納入單因素分析的指標包括化療前uPA含量、化療6個療程后uPA含量、FIGO分期、有無淋巴結(jié)、殘余腫瘤直徑、組織學分級以及病理學類型。結(jié)果顯示： 化療前uPA含量≥1.28ng/ml(P<0.001，χ2=19.321，見圖1A；P<0.001，χ2=19.148，見圖1B)、化療6個療程后,uPA含量≥1.09ng/ml(P=0.008，χ2=7.027,見圖2A；P=0.012，χ2=6.351,見圖2B)、Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者(P<0.01，χ2=11.747；P<0.001，χ2=13.319)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001，χ2=18.429；P<0.001，χ2=19.463)、殘余瘤灶直徑≥1cm(P=0.014，χ2=6.017；P=0.035，χ2=4.434)的患者PFS和OS均較短。而中低分化卵巢癌的PFS和OS與高分化患者相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.733，P=0.662)，漿液性卵巢癌患者與非漿液性卵巢癌患者的PFS和OS差異無統(tǒng)計學意義(P=0.732，P=0.983)。

表2 上皮性卵巢癌化療前后血清中uPA 含量與臨床病理及其他因素的關(guān)系Tab.2 Correlations of serum uPA levels with clinicopathological characteristics of ovarian cancer patients

2.3.2 多因素生存分析 將單因素分析中顯示與PFS和OS相關(guān)的因素納入COX比例風險模型進行多因素分析。結(jié)果顯示： 化療前uPA陽性(uPA≥1.28ng/ml)和陰性(uPA<1.28ng/ml)患者的PFS平均值分別是22.80±5.2個月和40.38±3.4個月，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，HR=2.714)?；熐皍PA陽性和陰性患者的OS平均值分別為34.52±4.8個月和46.85±3.1個月，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，HR=2.894)。卵巢癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者和無轉(zhuǎn)移患者的PFS平均值分別為20.57±6.2個月和37.16±4.1個月，OS分別為31.93±3.8個月和45.26±1.5個月，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。而化療6個療程后uPA陽性(uPA≥1.09ng/ml)和陰性(uPA<1.09ng/ml)患者的PFS平均值分別為26.96±5.7個月和37.54±7.2個月，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；OS平均值分別為38.06±6.2個月和44.32±5.4個月，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。FIGO分期Ⅰ/Ⅱ與Ⅲ/Ⅳ期患者比較PFS及OS差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，卵巢癌殘余瘤灶直徑≥1cm和<1cm的患者比較，PFS及OS差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

圖1 化療前uPA含量對PFS、OS的影響Fig.1 Association of serum uPA before chemotherapywith PFS and OSA: PFS;B: OS

圖2 化療后uPA含量對PFS、OS的影響Fig.2 Association of serum uPA after chemotherapy with PFS and OSA： PFS；B： OS表3 影響行腫瘤細胞減滅術(shù)后卵巢癌患者PFS和OS的相關(guān)因素分析Tab.3 Risk factors of PFS and OS of patients after ovarian cancer debulking surgery

因 素PFSOSHR95%CIP值HR95%CIP值化療前uPA2.7141.111～6.6260.0282.8941.128～7.4240.0276療程后uPA1.0930.494～2.4170.8270.8210.341～1.9740.659FIGO分期0.6970.294～1.6530.4120.4700.203～1.0920.079淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.4290.193～0.9550.0380.3540.159～0.7880.011殘余腫瘤直徑0.9800.454～2.1140.9581.0600.500～2.2460.879

3 討 論

基底膜的破壞，ECM的降解或ECM成分的改變是腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為發(fā)生的前提條件，因此各種蛋白水解酶的含量可以用來衡量腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移能力的強弱。纖溶酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)系統(tǒng)是ECM中最重要的蛋白酶系統(tǒng)，uPA不僅能直接激活纖溶酶促進ECM中大多數(shù)蛋白的降解，還能激活MMP系統(tǒng)，加強膠原、彈性蛋白等的降解。在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，uPA系統(tǒng)介導的基質(zhì)纖維蛋白降解過程起著核心作用。脈管系統(tǒng)是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中必不可少的一部分，腫瘤細胞也可通過脈管系統(tǒng)向全身轉(zhuǎn)移。ECM中存儲著多種類型細胞如巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等分泌的生長因子，纖溶酶原被uPA激活降解ECM的同時，這些生長因子被釋放，當它們與其相應(yīng)的受體結(jié)合后，能夠啟動Ras-Raf-Mek-Erk信號傳導通路，從而刺激腫瘤的血管生成。除此之外，它們還可以促進uPA的表達，因此這些生長因子能夠與uPA系統(tǒng)相互作用，共同促進腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。uPA在人類各種惡性腫瘤[3-6]中的表達水平遠遠高于其相應(yīng)的正常組織，且uPA的表達水平與腫瘤的侵襲能力呈正相關(guān)，uPA的表達水平越高，患者預后越差，生存期越短。

本研究結(jié)果顯示： 化療前及化療6個療程后外周血中uPA的含量明顯高于正常對照組，同一卵巢癌患者化療前血清中uPA的含量與化療6個療程后也有顯著性差異。提示術(shù)后且無論是否有殘存病灶，患者體內(nèi)仍有腫瘤細胞存在，因此患者血清中uPA的含量尚未恢復到正常水平。在Ⅲ～Ⅳ期上皮性卵巢癌患者化療前后血清中uPA的含量明顯均高于Ⅰ～Ⅱ期，說明卵巢癌患者的臨床期別越高，外周血uPA的水平越高。術(shù)后有殘存病灶、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者化療前及化療6個療程后血清中uPA的濃度也高于無殘存病灶、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。這些結(jié)果均提示uPA的含量與腫瘤本身的惡性程度相關(guān)。Cai等[7],van der Burg等[8]的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相似： 均提示化療前及化療后uPA的濃度與細胞分化程度、病理類型差異無統(tǒng)計學意義。因此，uPA的濃度是否與EOC組織學類型及分化程度相關(guān)，有待于進一步的研究證實。

有關(guān)uPA的表達與卵巢惡性腫瘤患者預后的相關(guān)性，尚無一致報道。Konecny等[9]用ELISA法檢測了103例上皮性卵巢癌中uPA的表達水平，提示采用單因素分析時uPA水平是影響患者OS的危險因素。Hoffmann等[10]對98例卵巢癌患者的研究結(jié)果也表明uPA可作為預后的預測指標。但Kuhn等[11]對FIGOⅢC卵巢癌患者的預后進行了單因素及多因素生存分析，發(fā)現(xiàn)uPA不是一個獨立的預后因子。本研究顯示，采用單因素分析時，化療前uPA水平和化療6療程后uPA水平都是影響PFS和OS的因素。但納入多因素的COX模型分析后，僅化療前uPA水平與預后相關(guān)，提示其可作為評估上皮性卵巢癌預后的獨立指標。化療后患者uPA含量并非患者PFS及OS的獨立危險因素，這一結(jié)果是否因卵巢癌患者經(jīng)過規(guī)范化化療后病情暫時緩解，或隨訪時間尚短不足以顯示差別，有待于進一步探究。另外，Chen等[12]檢測了同一批患者血清治療過程中血漿纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor 1, PAI-1)水平，發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者PAI-1水平較對照組高，且化療前患者血清中PAI-1的水平與患者預后相關(guān)，雖然PAI-1為uPA的抑制劑，但對兩者的相關(guān)性進行研究發(fā)現(xiàn)其表達水平并無明顯相關(guān)性。因此，推測兩者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制及其對卵巢癌患者預后的影響并不能單純用兩者相互拮抗的機制來解釋。其具體作用機理需進一步研究。

綜上所述，本研究顯示已行腫瘤細胞減滅術(shù)的卵巢癌患者化療前血清中的uPA含量可作為評估患者預后的獨立因子。卵巢癌的浸潤轉(zhuǎn)移過程是一個非常復雜的生物學行為，其中不僅包括纖溶蛋白酶的調(diào)控機制，還涉及多種細胞因子與腫瘤轉(zhuǎn)移基因的作用，因此其預后也牽涉到多方面，且uPA在腫瘤中的作用機制尚未完全清楚，有關(guān)研究也主要集中在體外實驗，所以有關(guān)uPA與卵巢癌預后的關(guān)系仍需更深入的研究。

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Variation and prognostic value of serum uPA before and after chemotherapy in patients with epithelial ovarian carcinoma

LILi,SHENAi-qun，CHENShu-tong，CHENKe-wei，LIHuai-fang，OUYANGYi-qin

(Dept. of Gynecology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate variation and prognostic value of serum urokinase-type plasminigen activator (uPA) before and after chemotherapy in patients with epithelial ovarian carcinoma. Methods One hundred and seven patients with ovarian carcinoma receive chemotherapy after cytoreductive surgery. Serum uPA levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) before chemotherapy and after 6 cycles of chemotherapy. One hundred and two health subjects served as controls. Results Serum uPA levels of patients were significantly higher than that of healthy women before and after chemotherapy (bothP<0.05); while uPA levels in patients before chemotherapy was significantly higher than those after the chemotherapy. Kaplan-Meier analysis indicated the serum uPA level before and after chemotherapy, FIGO stage, residual tumor size and lymph node metastasis were all associated with progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) of ovarian carcinoma patients. Multivariate Cox regression analysis revealed that the serum uPA level and lymph node metastasis were independent prognostic factors for both PFS and OS (allP<0.05). Conclusion Patients with epithelial ovarian carcinoma have high serum uPA levels both before and after chemotherapy. Pre-chemotherapy uPA level might be used for prognosis of ovarian carcinoma patients.

ovarian carcinoma; urokinase-type plasminogen activator; serum; prognosis

10.16118/j.1008-0392.2015.04.016

2015-01-19

國家自然科學基金(81101967)

李 莉(1969—)，女，主任醫(yī)師，碩士.E-mail： lili_691969@sina.com

李懷芳.E-mail: haifangli@126.com

R 737.31

A

1008-0392(2015)04-0080-06