匡雅姝, 夏金盈, 羅軼瑋, 梅 林, 劉學(xué)波, 李 瑩

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200120)

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·臨床研究·

糖尿病合并不同程度冠狀動脈粥樣硬化患者外周血EMP及EPC水平的研究

匡雅姝, 夏金盈, 羅軼瑋, 梅 林, 劉學(xué)波, 李 瑩

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200120)

目的 探討糖尿病患者EMPs、EPCs與不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變及糖代謝異常的關(guān)系。方法 117例糖尿病患者，根據(jù)臨床癥狀、心肌標(biāo)記物水平以及冠狀動脈造影及冠脈內(nèi)血管超生(IVUS)結(jié)果，將患者分為急性冠脈綜合癥組(A組，n=45)、穩(wěn)定型心絞痛組(B組，n=27)、冠狀動脈病變組(狹窄<50%，C組，n=45)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測3組患者外周血中CD144+/Annexin V+的內(nèi)皮微顆粒以及CD34+/CD39+內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平，并檢測血脂、血糖、糖化血紅蛋白、炎性指標(biāo)、心肌標(biāo)記物、肝腎功能等各項指標(biāo)。結(jié)果 3組相比，年齡、性別、血壓、吸煙、體質(zhì)量指數(shù)、血脂等組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。超敏C反應(yīng)蛋白、CK-MB、HsTnT均在A組中較高，與其余兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。3組之間空腹血糖、餐后血糖及糖化血紅蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義。外周血的CD144+/Annexin V+EMPs水平3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中A組顯著高于B組(P<0.05)，且A、B組CD144+/Annexin V+EMPs水平顯著高于C組(P<0.05)，EMPs水平與糖化血紅蛋白不相關(guān)。A、B組外周血CD34+/CD39+EPCs水平顯著低于C組(P<0.05)，而A、B組間無差異，且EPCs水平與糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論 糖尿病患者冠脈病變加重是導(dǎo)致外周血CD144+/Annexin V+EMPs水平升高的主導(dǎo)損傷因素。糖代謝異常對內(nèi)皮功能的損傷主要是通過損傷內(nèi)皮修復(fù)功能因素實現(xiàn)的。

內(nèi)皮微顆粒； 內(nèi)皮祖細(xì)胞； 冠心病； 急性冠脈綜合征； 穩(wěn)定性心絞痛； 內(nèi)皮功能

血管內(nèi)皮系統(tǒng)是重要的血管屏障，是感知血流中物理性及化學(xué)性改變的主要感受器[1]。內(nèi)皮系統(tǒng)的自我平衡被打亂將會破壞血管內(nèi)皮原有的生理功能，從而發(fā)生血管內(nèi)皮功能受損[2]。而內(nèi)皮功能障礙貫穿于動脈粥樣硬化以及斑塊不穩(wěn)定的始終。近年來內(nèi)皮微顆粒(endothelial micropa rticles, EMP)作為評價內(nèi)皮功能的新的臨床指標(biāo)成為研究熱點。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)許多血管相關(guān)性疾病，如糖尿病、代謝綜合征、冠狀動脈粥樣硬化性疾病等外周血中EMPs都增高[3]。李瑩等[4]的研究也證實EMP與冠心病患者斑塊不穩(wěn)定的臨床指標(biāo)有著良好的相關(guān)性，也有研究[5]證實在糖尿病患者冠狀動脈病變EMP的水平也相應(yīng)升高。同時，來源于骨髓的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells， EPCs)在某些生理或病理因素刺激下，從骨髓動員到外周血，維持血管的穩(wěn)定性，并參與血管修復(fù)或形成,被視為一種內(nèi)皮修復(fù)的指標(biāo)。

基于以上背景，本研究依據(jù)冠狀動脈造影及冠脈內(nèi)血管超生(IVUS)和臨床資料將患者分組，分別測定其外周血循環(huán)的CD144+/Annexin V+的內(nèi)皮微顆粒以及CD34+/CD39+內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平，研究糖代謝異常的冠心病患者中，EMPs、EPCs在內(nèi)皮功能的損傷和修復(fù)過程中的作用，探討EMPs、EPCs與不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變以及糖代謝異常的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取糖尿病患者117例，根據(jù)冠狀動脈造影及冠脈內(nèi)血管超聲(intravenous ultrasound， IVUS)和臨床資料，研究對象分為A組: 急性冠脈綜合征(n=45)、B組: 穩(wěn)定型心絞痛組(n=27)、C組: 冠狀動脈病變(狹窄<50%)組(n=45)。所有患者排除酮癥酸中毒、高滲性昏迷、乳酸酸中毒、感染急性期、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病。

1.2 儀器與試劑

標(biāo)記微顆粒以及細(xì)胞的抗體均購自美國BD Biosciences公司。已知濃度的絕對計數(shù)微球購自美國Beckman Coulter公司。FACs CaliburTM流式細(xì)胞儀購自Becton Dickinson公司。1.1μm的標(biāo)準(zhǔn)微球購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 血漿EMP水平的測定 取患者外周血2ml置于檸檬酸鈉鹽抗凝管中，離心半徑15cm，160r/min,離心10min，獲得富血小板血漿，再進(jìn)行離心半徑7cm,1000r/min,離心6min，獲得貧血小板血漿。取貧血小板血漿樣本50μl，加入5μl異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的Annexin V抗體和10μl藻紅蛋白熒光(P-phycoerythrin, PE)標(biāo)記的抗CD144抗體充分混勻。在室溫下避光孵育25min后，樣本內(nèi)加入50μl已知濃度的絕對計數(shù)微球，再加入1000ml PBS緩沖液，混勻后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。樣本檢測前以直徑1.1μm的標(biāo)準(zhǔn)微球作為內(nèi)參，幫助EMPs定門。門內(nèi)收集到的微顆粒進(jìn)一步在525nm和575nm的光電倍增管進(jìn)行異硫氰酸熒光素(FITC)和PE強度分析[6]。在流式細(xì)胞儀上讀取5000個絕對計數(shù)微球后停止計數(shù)，依據(jù)絕對計數(shù)微球的濃度換算得出循環(huán)EMPs的濃度。

1.3.2 EPCs水平測定 取患者的外周血2ml置于肝素抗凝管中，從管中取100μl全血與10μl FITC標(biāo)記的抗CD34抗體和10μl PE標(biāo)記的抗CD39抗體充分混勻，或同等數(shù)量的同型對照抗體，在室溫下避光孵育20min。在管中加入3ml紅細(xì)胞裂解液，充分混勻后繼續(xù)在室溫下避光裂解20min。離心半徑15cm，160r/min,離心5min，倒去上清液，再加入3ml紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)上述離心后倒去上清液，管中剩下單個核細(xì)胞，加入2ml生理鹽水，混勻后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，計數(shù)5000個細(xì)胞后停止，讀出CD34+CD39+EPCs的百分比。EPCs定義為CD34+CD39+EPCs,患者外周血循環(huán)的EPCs數(shù)量的計算公式為: 流式細(xì)胞儀上讀出的CD34+CD39+EPCs的百分比×患者外周血中(淋巴細(xì)胞絕對數(shù)+單核細(xì)胞絕對數(shù))。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 患者基本臨床資料比較

3組患者年齡、性別、血壓、吸煙、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)3組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.001)。超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、CK-MB、HsTnT均在A組中較高，與B、C組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，且A組顯著高于B組(P<0.001)。3組之間空腹血糖(FBG)、餐后2h血糖(2hPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

表1 3組患者一般資料對比Tab.1 General information of patients in three groups

2.2 患者CD144+/Annexin V+EMPs水平

結(jié)果顯示，外周血的CD144+/Annexin V+EMPs水平3組間有統(tǒng)計學(xué)差異，其中A組顯著高于B組(P<0.05)，且A、B組CD144+/Annexin V+EMPs水平顯著高于C組(P<0.05)，EMPs水平與糖化血紅蛋白不相關(guān)(P>0.05),見圖1、圖2。

2.3 患者CD34+/CD39+EPCs水平

結(jié)果顯示，三組進(jìn)行組間比較，A、B組外周血CD34+/CD39+EPCs水平顯著低于C組(P<0.05)，而A、B組間外周血CD34+/CD39+EPCs水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且EPCs水平與糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)(P<0.05，r=-0.365)，見圖3。

圖1 3組患者外周血CD144+/Annexin V+EMPs的水平Fig.1 CD144+/Annexin V+EMPs level in peripheral blood of three groups

A組

B組

C組 圖2 3組CD144+Annexin V+EMPs的流式細(xì)胞圖 Fig.2 Flow cytometry results of CD144+Annexin V+EMPs in three groups FITC熒光(Annexin V-FITC)定為X軸，將PE熒光(CD144-PE)定為Y軸，R3區(qū)域即為CD144+Annexin V+EMPs數(shù)量(右上)。

圖3 3組患者外周血CD34+/CD39+EPCs的水平Fig.3 CD34+/CD39+EPCs level in peripheral blood of three groups

3 討 論

1990年，Hamilton首次提出內(nèi)皮微顆粒的概念。隨后對內(nèi)皮微顆粒的研究，指出內(nèi)皮微顆粒是在內(nèi)皮細(xì)胞在受到多種因素刺激激活或者損傷時，細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層脂質(zhì)的非對稱分布受到破壞，細(xì)胞內(nèi)鈣離子快速上升，激活翻轉(zhuǎn)酶，使主要由磷脂酰胺酸組成的帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜內(nèi)層外翻，發(fā)生細(xì)胞骨架重構(gòu)，隨后發(fā)生膜出泡反應(yīng)以及EMP的脫落。這些內(nèi)皮微顆粒攜帶所有來源的內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EMP所表達(dá)的抗原有CD31、CD51、CD54、CD61E、CD105、CD144或CD146。本研究采用CD144+/Annexin V+標(biāo)記EMPs，其中CD144是只在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的一種黏附分子，具有維持內(nèi)皮黏附連接的作用。而Annexin V是發(fā)生凋亡的標(biāo)志性分子，研究[4]表明，二者標(biāo)志的EMPs對評價ACS具有良好的臨床價值[4]。

本實驗結(jié)果顯示，A、B組外周血中CD144+/Annexin V+EMPs水平顯著高于C組，且A組外周血中CD144+/Annexin V+EMPs水平顯著高于B組，由此可見，冠狀動脈粥樣硬化引起的內(nèi)皮損傷加重是導(dǎo)致外周血CD144+/Annexin V+EMPs水平升高的主導(dǎo)損傷因素，從而推測CD144+/Annexin V+EMPs可作為ACS患者急性缺血時內(nèi)皮功能損傷的特異性指標(biāo)。

Asahara等[7]首先從外周血中分離出能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)。EPCs來源于骨髓，是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體。在某些生理或病理條件刺激下，EPCs可以從骨髓動員到外周血，分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管壁的穩(wěn)定性，并參與血管的修復(fù)或形成。研究顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞在心腦血管疾病、外周血管疾病、腫瘤血管形成以及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮重要作用，損傷性刺激、外源性細(xì)胞因子和藥物治療可以增強EPCs的動員[8-10]。目前主要采用流式細(xì)胞儀來確定細(xì)胞表面抗原CD34、CD133、KDR，對EPCs進(jìn)行鑒定[11-12]。

本研究結(jié)果顯示，冠脈病變<50%以及無冠脈病變的患者外周血CD34+/CD39+EPCs水平顯著高于合并急性冠脈綜合征以及穩(wěn)定性心絞痛患者外周血CD34+/CD39+EPCs水平，提示內(nèi)皮修復(fù)功能的增強是減弱粥樣硬化造成的血管壁損傷的重要保證。

糖尿病目前已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。同時，糖尿病也是心血管疾病重要的危險因素，糖尿病患者患心血管疾病的風(fēng)險是無糖尿病者的2倍[13-14]。內(nèi)皮細(xì)胞受損發(fā)生在糖尿病早期，也是糖尿病并發(fā)血管疾病的始動因素。有研究顯示，患有急性冠脈綜合征患者合并糖尿病可以獨立于其他危險因素，增加了患者兩倍的長期(1年)以及短期(30d)死亡率[15]。內(nèi)皮微顆粒水平是糖尿病患者ACS后30d以及6個月死亡率的獨立預(yù)測因子，但是具體機制不詳[15]。也有研究[16]提示，EMP水平與內(nèi)皮依賴性血管功能以及血管事件相關(guān)，且糖尿病仍然是事件復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因子。Tushizen等[17]通過實驗證實高血糖可以使EMPs水平升高。

本研究選取的研究對象全部為2型糖尿病患者，根據(jù)冠脈病變程度進(jìn)行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠狀動脈病變嚴(yán)重的患者外周血EMPs水平均高于冠脈病變相對較輕的患者，然而即便對于冠狀動脈病變最嚴(yán)重的ACS患者而言，患者外周血EMPs水平與糖化血紅蛋白水平不相關(guān)。這一結(jié)果表明冠狀動脈粥樣硬化造成的內(nèi)皮功能的損傷掩蓋了由于糖代謝異常對內(nèi)皮的損傷，粥樣硬化病變的嚴(yán)重程度對內(nèi)皮功能的損傷占主導(dǎo)因素。

Krankel等[18]、王洪祥等[19]研究表明高血糖可以抑制EPCs的遷移和整合能力，是EPCs的增值減弱，凋亡增加。本研究中，冠脈病變較明顯的A、B組EPCs水平顯著下降，且二組EPCs與糖化血紅蛋白呈負(fù)相關(guān)，由此說明，糖尿病患者內(nèi)皮受損嚴(yán)重，修復(fù)潛能降低，而糖代謝異常對內(nèi)皮功能的損傷主要是通過損傷內(nèi)皮功能的修復(fù)因素實現(xiàn)的。

綜上所述，冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生及斑塊的不穩(wěn)定是導(dǎo)致外周血CD144+/Annexin V+EMPs水平升高的主導(dǎo)損傷因素。而與冠脈病變相對較重的患者相比，病變較輕的患者外周血EPCs水平顯著升高，提示內(nèi)皮修復(fù)功能因素的增強是減輕冠脈病變的重要保證。糖尿病患者外周血EPCs水平與糖化血紅蛋白水平呈負(fù)相關(guān)，提示糖代謝異常對內(nèi)皮功能的損傷主要是通過損傷內(nèi)皮修復(fù)功能因素實現(xiàn)的。本研究雖取得了初步的結(jié)果，但仍需要大樣本、多中心、前瞻性研究進(jìn)一步證實，并且此結(jié)果尚需體外實驗加以證實。關(guān)于對EMP如何量化，來進(jìn)一步預(yù)測冠脈斑塊穩(wěn)定性以及有關(guān)EPCs對內(nèi)皮保護(hù)性能力的研究，仍需進(jìn)一步探討。

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Plasma EMPs and EPCs levels in diabetic patients with coronary atherosclerotic lesions

KUANGYa-shu，XIAJin-ying，LUOYi-wei，MEILin，LIUXue-bo，LIYing

(Dept. of Cardiology, East Hospital, Tongji University， Shanghai 200120， China)

Objective To investigate plasma EMPs and EPCs levels in diabetic patients with different degree of coronary atherosclerotic lesions. Methods One hundred and seventeen diabetic patients with different degree of coronary atherosclerotic lesions were enrolled in the study. Patients were classified into 3 categories based on clinical symptoms, cardiac marker levels, coronary angiography and coronary intravenous ultrasound (IVUS): acute coronary syndrome(group A,n=45), stable angina(group B,n=27) and coronary artery disease(stenosis <50%)(group C,n=45). CD144+/Annexin V+endothelial microparticles(EMPs) and CD34+/CD39+endothelial progenitor cells(EPCs) in peripheral blood were detected by flow cytometry; and blood lipid, glucose, glycosylated hemoglobin, inflammatory markers, cardiac markers, liver and renal function, and other indicators were also measured. Results There were no significant differences in age, sex, blood pressure, smoking, body mass index and blood lipid among three groups. High sensitivity C-reactive protein, CK-MB and HsTnT levels were significantly higher in group A than those in other two groups(P<0.001). There were not significant differences in fasting blood glucose, postprandial blood glucose and glycosylated hemoglobin among 3 groups. The CD144+/Annexin V+ EMPs levels in peripheral blood of group A was significantly higher than those of group B(P<0.05), and EPCs levels in group A and B was significantly higher than those in group C(P<0.05). EMPs levels were not correlated with glycosylated hemoglobin levels. The levels of peripheral blood CD34+/CD39+EPCs in group A and B were significantly lower than those in group C(P<0.05), but there were no differences between group A and B. The levels of EPCs and the levels of glycosylated hemoglobin were negatively correlated. Conclusion Aggravating coronary lesions is a leading cause of elevated peripheral blood CD144+/Annexin V+ EMPs. Abnormal glucose metabolism in diabetic patients may injury endothelial repair factors and result in aggravation of coronary lesions.

endothelial microparticles； endothelial progenitor cells； coronary heart disease； acute coronary syndrome； stable angina； endothelial function

10.16118/j.1008-0392.2015.04.010

2015-03-23

上海市科委攻關(guān)項目(10411968000)；上海市浦東新區(qū)科委課題(PKJd2013-Y19)

匡雅姝(1988—)，女，碩士研究生.E-mail: kuangyashu@163.com

李 瑩.E-mail: yingcnli@gmail.com

R 543

A

1008-0392(2015)04-0047-06