趙 敏， 范秋淋， 劉維薇， 陳春球， 李 智

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072； 2. 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215000；3. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科，上海 200072； 4.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院檢驗科，上海 200090)

?

·基礎(chǔ)研究·

屋塵螨2種致敏方式誘導的小鼠氣道炎癥表型的比較分析

趙 敏1， 范秋淋2， 劉維薇1， 陳春球3， 李 智4

(1. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072； 2. 蘇州大學醫(yī)學部，江蘇 蘇州 215000；3. 同濟大學附屬第十人民醫(yī)院胃腸外科，上海 200072； 4.同濟大學附屬楊浦醫(yī)院檢驗科，上海 200090)

目的 比較屋塵螨(house dust mite, HDM)2種不同致敏方式對小鼠氣道炎癥表型的不同影響。方法 24只BALB/c小鼠隨機分為3組，每組8只,PBS組和鼻滴法組小鼠于實驗第1天、第7天、第14天、第21天經(jīng)鼻腔分別滴注50μl PBS液或HDM液(100μg)。經(jīng)腹腔注射組小鼠于實驗第1、14、21天經(jīng)腹腔注射50μl HDM液(40μg)，于實驗第26天、第27天、第28天霧化吸入HDM液(40μg)20min。采用頭體積描記法測量小鼠的氣道反應(yīng)性；對支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BAL)進行細胞計數(shù)和分類；ELISA法檢測BAL中CXCL1、CXCL2、CCL11、IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的表達及血清免疫球蛋白(HDM-IgG1、HDM-IgG2a、HDM-IgE)的含量；對肺組織PAS染色后進行病理學觀察。結(jié)果 鼻滴法誘導了以中性粒細胞為主的氣道炎癥并伴CXCL1蛋白水平升高、血清HDM-IgG1含量增加及肺組織高腳杯細胞增多等病理學改變，但血清HDM-IgE的含量和氣道反應(yīng)性未見改變。經(jīng)腹腔注射法則誘導了更加劇烈的氣道炎癥反應(yīng)(以嗜酸性粒細胞為主)、BAL中CXCL1、IL-5蛋白水平升高、血清免疫球蛋白(HDM-IgG1、HDM-IgG2a、HDM-IgE)含量增加、氣道反應(yīng)性下降以及肺組織病理學改變。結(jié)論 HDM鼻滴法和經(jīng)腹腔注射法誘導了不同類型的小鼠氣道炎癥反應(yīng)。

屋塵螨； 氣道炎癥； 鼻滴法； 經(jīng)腹腔注射法； 小鼠

屋塵螨(house dust mite, HDM)是常見的過敏原，與人類哮喘的發(fā)生密切相關(guān)，其致敏作用已在動物模型中得到較多的研究。然而由于不同的研究中，采用的致敏方法與方案、小鼠種類、檢測體系等因素的不同，HDM所誘導的炎癥表型各有差異。鼻滴注與經(jīng)腹腔注射法是建立小鼠哮喘模型常用的方法，本研究在同一小鼠模型中比較兩種不同致敏方式對小鼠氣道炎癥表型的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型雌性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購于德國Harlan Winkelmann中心，所有小鼠均在無致病菌環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

HDM提取物購自美國Greer Labs公司。小鼠IgG1、IgG2a、IgE ELISA 試劑盒及小鼠IL-5、IFN-γ、IL-10抗體購自美國BD Pharmingen公司；小鼠CXCL1、CXCL2、CCL11 (eotaxin)、IL-17試劑盒購自美國R&D公司；CASY?TT細胞計數(shù)儀購自德國Sch?rfe System 公司；Sunrise酶標儀購自德國Tecan 公司；Cytocentrifuge Cytospin 3離心機購自英國Shandon公司；Centrifuge Megafuge 1.0R離心機購自德國Heraeus公司；Olympus顯微鏡BX51購自日本Olympus公司。

1.3 動物分組及處理

BALB/c小鼠24只，隨機分為3組: PBS陰性對照組(PBS組)、經(jīng)鼻腔滴注組(HDM1組)、經(jīng)腹腔注射組(HDM2組)，每組8只。PBS組和HDM1組小鼠于實驗第1天、第7天、第14天、第21天經(jīng)鼻腔分別滴注50μl PBS液或HDM液(100μg/50μl PBS)。實驗第23天，測量小鼠的氣道反應(yīng)性(airway reactivity, AR)。實驗第24天，將小鼠處死后采集標本進行檢測。HDM2組小鼠于實驗第1天、第14天、第21天經(jīng)腹腔注射50μl HDM液(40μg/50μl PBS)，實驗第26天、第27天、第28天霧化吸入HDM液(40μg/50μl PBS)20min。實驗第30天，測量小鼠的AR。實驗第31天，將小鼠處死后采集標本進行檢測。

1.4 氣道反應(yīng)性測量

采用頭體積描記法測量小鼠的氣道反應(yīng)性。結(jié)果記錄為Mch 50(mg/ml)，表示引起呼氣中段流量基線水平(baseline midexpiratory airflow)下降50% 的乙酰甲膽堿濃度。

1.5 BAL細胞分類計數(shù)及細胞因子檢測

小鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后，仰臥固定，氣管針插管，注入1ml預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的PBS液進行支氣管肺泡灌洗，共3次。4℃，離心半徑10cm，1200r/min，離心10min，收集上清獲得支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BAL)，-80℃保存。細胞沉淀用含1% BSA的PBS液1ml重懸，細胞計數(shù)儀測量細胞總數(shù)后，取50μl重懸液1∶200稀釋，離心制備細胞涂片，吉姆薩染色，顯微鏡下分類計數(shù)。ELISA法檢測BAL中CXCL1、CXCL2、CCL11及IL-5、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量。

1.6 血清HDM-IgG1、HDM-IgG2、HDM-IgE檢測

經(jīng)小鼠腋靜脈采集靜脈血0.8ml，室溫下靜置1h。4℃，離心半徑10cm，2000r/min，離心10min，留取血清。ELISA法檢測血清HDM-IgG1、HDM-IgG2、HDM-IgE。

1.7 肺組織病理學觀察

結(jié)扎支氣管，切取左肺組織，置6%福爾馬林液固定過夜，石蠟包埋后連續(xù)5μm切片，PAS染色。顯微鏡下觀察肺組織病理學變化，使用CAST系統(tǒng)計算高腳杯細胞百分比和黏液分泌物含量。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 HDM致敏引起的氣道炎癥反應(yīng)

鼻滴與經(jīng)腹腔注射HDM過敏原引起了小鼠氣道不同程度的白細胞募集。與PBS組相比，HDM1組小鼠氣道中性粒細胞升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，HDM2組小鼠氣道白細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數(shù)目均增加，中性粒細胞數(shù)目亦增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)白細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數(shù)目未見顯著改變。2組致敏小鼠中，HDM2組小鼠氣道白細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數(shù)目較HDM1組小鼠增加(P<0.01)；中性粒細胞數(shù)目較HDM1組減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。與PBS組相比，HDM2組小鼠氣道反應(yīng)性降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，HDM1組小鼠氣道反應(yīng)性未見明顯改變。

2.2 BAL中趨化因子和細胞因子蛋白水平的改變

與PBS組相比，HDM1及HDM2組BAL中CXCL1蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)。HDM2組同時可見IL-5蛋白含量增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。兩組致敏小鼠中，HDM2組IL-5蛋白含量較HDM1增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。CXCL2、CCL11、IFN-γ、IL-10和IL-17的含量在各組小鼠中均低于檢測下限。

圖1 2種致敏方式在小鼠模型中引起的氣道炎癥Fig.1 The airway inflammation induced by HDM with two sensitizing methods in mice*P<0.05,**P<0.01

2.3 HDM-IgG1、HDM-IgG2a、HDM-IgE含量的變化

HDM1組小鼠血清HDM-IgG1含量較PBS組明顯增加，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，HDM-IgG2a、HDM-IgE含量未見顯著性改變。HDM2組小鼠血清HDM-IgG1、HDM-IgG12a、HDM-IgE含量均高于PBS及HDM1組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖3。

2.4 HDM引起肺組織中高腳杯細胞增生和黏液分泌增加

經(jīng)PAS染色后，PBS組小鼠肺組織切片未見明顯病理改變，各級支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)規(guī)則且完整，小支氣管及血管周圍無炎性細胞浸潤，支氣管管壁黏膜完整無斷裂及脫落。HDM1和HDM2組肺組織切片小支氣管及血管周圍均見明顯的炎性細胞浸潤，支氣管上皮細胞部分斷裂及脫落，見圖4。與PBS組相比，高腳杯細胞增生顯著增加(P<0.01)且黏液分泌物顯著增多(P<0.01)，HDM1與HDM2組相比，差異無統(tǒng)計學意義，見圖5。

圖2 小鼠BAL液中CXCL1和IL-5蛋白水平的改變Fig.2 The protein levels of CXCL1 and IL-5 in BAL*P<0.05；**P<0.01

圖3 小鼠血清中HDM-IgG1、IgG2a和IgE的含量Fig.3 The protein contents of HDM-IgG1， IgG2a and IgE in serum*P< 0.05,**P<0.01

圖4 小鼠肺組織病理學檢測結(jié)果Fig.4 Pathological observations in lung tissues(PAS,×10)

圖5 高腳杯細胞及黏液分泌物的含量比較Fig.5 Comparison of percentage of goblet cell and content of mucus與PBS組相比，*P<0.01

3 討 論

哮喘是一種常見的慢性呼吸道疾病，其發(fā)病是一個復雜的多樣化過程，遺傳、環(huán)境、宿主以及飲食等因素均影響了哮喘的發(fā)生。近年來，哮喘的發(fā)病在國內(nèi)城市兒童中呈逐步上升的趨勢[1]。由于不同個體間哮喘常表現(xiàn)為不同的亞型，因而增加了其診斷和治療的困難性。全球哮喘防治創(chuàng)議(Global INitiative for Asthma, GINA) 2014版強調(diào)了哮喘是一種“以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病”，有過敏性哮喘、非過敏性哮喘、遲發(fā)型哮喘、伴有固定氣流受限的哮喘、伴有肥胖的哮喘等多種表型，并且認為在一些重癥哮喘中，表型也許可以指導治療[2]。

小鼠哮喘模型的建立是探討哮喘發(fā)病機制的一種有效手段。Cates等[3]首次以HDM作為抗原，連續(xù)10d向小鼠鼻腔注入25μg HDM，導致其體內(nèi)Th2細胞活化及嗜酸性氣道炎癥。然而在不同的實驗[4]中，由于HDM抗原組分的不同可引起不同的細胞因子釋放，導致不同的細胞活化。本課題組的前期研究[5-6]通過給小鼠鼻滴HDM抗原，誘導了以中性粒細胞和嗜酸性粒細胞為主的混合型氣道炎癥反應(yīng)，與Cates等[3]的研究不同，這可能與過敏原的異質(zhì)性有關(guān)。致敏方案的差異可能引起小鼠哮喘表型的改變[7]。本研究進一步比較了HDM 2種致敏方式(鼻滴和經(jīng)腹腔注射)在同一小鼠模型中的作用，發(fā)現(xiàn)鼻滴法誘導了以中性粒細胞為主的氣道炎癥并伴CXCL1蛋白水平升高、血清HDM-IgG1含量增加及肺組織高腳杯細胞增多等病理學改變，但小鼠氣道反應(yīng)性和血清HDM-IgE的含量未見改變。經(jīng)腹腔注射法則誘導了更加劇烈的氣道炎癥反應(yīng)(以嗜酸性粒細胞為主)、BAL中CXCL1、IL-5蛋白水平升高、血清免疫球蛋白(HDM-IgG1、HDM-IgG2a、HDM-IgE)含量增加、小鼠氣道反應(yīng)性下降以及肺組織病理學改變。

本研究中2種致敏方式所誘導的小鼠氣道炎癥表型間的差異主要在于炎癥細胞的類型和血清HDM-IgE的含量。由于HDM的致敏機理目前尚未形成定論，推測鼻滴法可能通過速發(fā)型過敏反應(yīng)引起中性粒細胞等在呼吸道的募集，該途徑不依賴于IgE的升高[8]；而經(jīng)腹腔注射法則可能通過T細胞的激活并釋放IL-5等Th2細胞因子，進而誘導IgE的合成并引起嗜酸性粒細胞數(shù)目的增加[7]，但其作用的具體分子機制有待進一步研究。為診斷和治療不同表型的哮喘(如不伴IgE升高的哮喘)提供理論依據(jù)。

[1] 全國兒科哮喘協(xié)作組中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所.第三次中國城市兒童哮喘流行病學調(diào)查[J].中華兒科雜志,2013,51(10): 729-735.

[2] Reddel HK, Hurd SS, FitzGerald JM. World Asthma Day. GINA 2014: a global asthma strategy for a global problem[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2014,18(5): 505-506.

[3] Cates EC, Fattouh R, Wattie J, et al. Intranasal exposure of mice to house dust mite elicits allergic airway inflammation via a GM-CSF-mediated mecha-nism[J]. J Immunol, 2004,173(10): 6384-6392.

[4] Post S, Nawijn MC, Hackett TL, et al. The composi-tion of house dust mite is critical for mucosal barrier dysfunction and allergic sensitization[J]. Thorax, 2012,67(6): 488-495.

[5] 趙敏,范秋淋,孫奮勇,等.屋塵螨提取液在BALB/c小鼠氣道炎癥中的作用[J].同濟大學學報: 醫(yī)學版,2015,36(1): 1-4.

[6] 趙敏,李智,于永春.屋塵螨在誘導BALB/c小鼠混合型氣道炎癥中的作用及致病機制探討[J].國際免疫學雜志,2013,36(4): 319-324.

[7] Chang YS, Kim YK, Bahn JW, et al. Comparison of asthma phenotypes using different sensitizing protocols in mice[J]. Korean J Intern Med, 2005,20(2): 152-158.

[8] Sibilano R1, Frossi B, Pucillo CE. Mast cell activation: a complex interplay of positive and negative signaling pathways[J]. Eur J Immunol, 2014,44(9): 2558-2566.

Comparison of phenotypes of airway inflammation induced by house dust mite with two different sensitizing methods in mice

ZHAOMin1,FANQiu-lin2,LIUWei-wei1,CHENChun-qiu3,LIZhi4

(1. Dept. of Clinical Laboratory, Tenth People’s Hospital,Tongji University, Shanghai 200072, China;2. Medical College of Soochow University, Suzhou 215000, China; 3. Dept. of Gastrointestinal Surgery, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 4. Dept. of Clinical Laboratory,Yangpu Hospital, Tongij University, Shanghai 200090, China)

Objective To compare the phenotypes of airway inflammation by using house dust mite(HDM) with two different methods in mice. Methods Twenty four female BALB/c mice were divided into 3 groups with 8 in each group. In PBS and intranasal group, the mice received an intranasal instillation of PBS or HDM(100μg) on 1st, 7th, 14th and 21st day, respectively. In intraperitoneal group, the mice received an intraperitoneal injection of HDM(40μg) on 1st, 14th and 21st day, and then nebulization of HDM (40μg) for 20 min on 26th, 27th and 28th day. After the final challenge, airway responsiveness(AR), immunological status and histological changes in the airways were examined. Results Intranasal instillation elicited a neutrophil-dominated airway inflammation which was accompanied by an elevated protein level of CXCL1 in bronchial alveolar lavage(BAL), an increased production of serum HDM-IgG1 and subsequent histological changes including goblet cell hyperplasia(GCH), but the serum HDM-IgE was not changed. Intraperitoneal injection led to a more robust airway inflammation(mainly eosinophils), increase of CXCL1 and IL-5 in the BAL, rise in serum immunoglobins levels(HDM-IgG1, HDM-IgG2a, HDM-IgE) and goblet cell hyperplasia in the lung tissue. Conclusion The two sensitizing methods of HDM induced different types of airway inflammation in mice.

house dust mite; airway inflammation; intranasal instillation; intraperitoneal injection; mice

10.16118/j.1008-0392.2015.04.008

2015-01-26

趙 敏(1978—),女,主管技師,博士.E-mail: zmin78@163.com

李 智.E-mail: lizhishi2001@163.com

R 562

A

1008-0392(2015)04-0038-05