劉仁鵬， 陳郭玲， 周 爽， 陶惠紅， 楊耀琴

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，上海 200092)

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·基礎(chǔ)研究·

趨化因子受體CCR7下調(diào)對95D肺癌細(xì)胞侵襲力的影響

劉仁鵬， 陳郭玲， 周 爽， 陶惠紅， 楊耀琴

(同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，上海 200092)

目的 探討趨化因子受體CCR7下調(diào)對95D肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲的影響及相關(guān)機(jī)制。方法 95D肺癌細(xì)胞經(jīng)不同劑量的白藜蘆醇處理后，通過免疫熒光染色、PCR、Western印跡法等觀察CCR7及其相關(guān)信號通路的表達(dá)。Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲和遷移能力。結(jié)果 白藜蘆醇處理后95D細(xì)胞CCR7表達(dá)顯著降低，與其相關(guān)的信號傳導(dǎo)蛋白PI3K、p-AKT表達(dá)量亦降低，并呈劑量依賴性。Transwell小室結(jié)果證明經(jīng)白藜蘆醇處理后的肺癌細(xì)胞侵襲力下降，同時也抑制CCR7配體對肺癌細(xì)胞的趨化作用。結(jié)論 本研究結(jié)果提示白藜蘆醇下調(diào)CCR7的表達(dá)同時也可下調(diào)PI3K、p-AKT表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的過程并促進(jìn)其凋亡。

CCR7； 白藜蘆醇； 侵襲； 次級淋巴組織趨化因子； 肺腫瘤

肺癌是最常見的惡性腫瘤，病程發(fā)展中瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是引起治療失敗和機(jī)體死亡的主要原因之一。組織中的淋巴組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine， SLC)能引導(dǎo)表達(dá)CCR7的初始T細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞(dendritic cell, DC)等免疫活性細(xì)胞定向遷移并聚集到周圍淋巴組織或腫瘤部位，參與免疫抑癌反應(yīng)，SLC/CCR7被認(rèn)為與機(jī)體免疫微環(huán)境的建立有關(guān)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)CCR7在多種惡性腫瘤組織中，如乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等表達(dá)水平升高[3-7]，且與腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究觀察天然藥物白藜蘆醇(resve-ratrol， Res)對肺癌細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響，并對CCR7表達(dá)水平變化與肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的相關(guān)性和機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑

人肺癌細(xì)胞95D購于中科院上海細(xì)胞生物研究所；Res購自美國Sigma公司；RPMI、 DMEM液體培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；MTT購自上海碧云天生物研究技術(shù)有限公司；CCR7抗體購自美國Ebioscience公司；GAPDH購自武漢博士德公司；SLC(CCL21)購自美國PeproTech公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；Transwell購自美國Corning公司；Matrigel膠購自美國BD Biosciences公司；引物設(shè)計購自上海生工生物有限公司；PI3K/AKT/p-AKT抗體購自美國Bioworld公司；Prime script 1st strand cDNA、SYBR RPremix Ex TaqTM(Perfect Real Time)購自日本TaKaRa公司；胰酶-EDTA購自上海生工試劑公司；DEPC購自美國Fluka公司；TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 熒光定量PCR檢測Res處理后CCR7在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

用TRIzol試劑抽提經(jīng)80μmol/L Res處理的95D細(xì)胞總RNA，以各組細(xì)胞cDNA為模板，對細(xì)胞中CCR7 mRNA 水平進(jìn)行Real-Time qPCR 檢測。CCR7上游引物為: 5′-AAGCGATG CGATGCTCT-CTC-3′，下游引物為: 5′-TTGCGCTCAAAGTTGC-GTG-3′；actin上游引物為: 5′-GACCTGTACGCC-AACACAG-3′，下游引物為: 5′-CTCAGGAGG AGCAATGATC-3′。PCR反應(yīng)條件: 95℃ 30s，95℃ 50s，60℃ 20s，72℃ 10s，共40個循環(huán)。計算Ct值。采用參照基因的ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量。ΔΔCt=(實驗組目的基因CCR7平均Ct值-實驗組內(nèi)參actin平均Ct值)-(對照組目的基因CCR7平均Ct值-對照組內(nèi)參基因actin平均Ct值)。

1.3 熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色測定CCR7在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)

制備95D細(xì)胞爬片，各實驗組經(jīng)Res處理24h，PBS洗滌，100%甲醇固定5～10min，PBS洗滌2遍，按免疫熒光化學(xué)反應(yīng)步驟操作: CCR7一抗1∶250稀釋，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗稀釋度1∶100，各步驟間均用PBS充分浸洗，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 Western 印跡法檢測Res處理后CCR7、PI3K、AKT、p-AKT表達(dá)的變化

使用濃度為0、20、40、80、120μmol/L in Res處理95D細(xì)胞24h后，PBS洗滌2遍，每孔加200μl的含有PMSF的蛋白裂解液，冰上裂解10min，4℃，離心半徑8cm，12000r/min，離心4min，取上清液，測試蛋白濃度，100℃水浴5min；取上樣蛋白10μg，10%濃縮膠[40%丙烯酰胺、雙蒸水、1.5mol/L Tris-HCI(pH8.8)、10%SDS、10%APS、TEMED]100V，15min；5%分離膠[40%丙烯酰胺、蒸水、1.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)、10%SDS、10%APS、TEMED]70V，45min；采用半干轉(zhuǎn)膜法，根據(jù)0.8mA/cm2PVDF膜面積計算設(shè)定電流值轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，一抗(GAPDH、CCR7、PI3K、AKT、p-AKT)4℃孵育過夜，次日用辣根標(biāo)記的二抗孵育，37℃，30min后，行ECL檢測。

1.5 Transwell小室測定肺癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力

95D細(xì)胞分組處理24h后，分別接種于標(biāo)準(zhǔn)Transwell小室(測定遷移)和預(yù)鋪Matrigel膠的Transwell小室(測定侵襲)1×104個/孔，并加入無血清DMEM培養(yǎng)液200μl，下層加入含200ng/ml SLC+2%FBS的DMEM培養(yǎng)液400μl，37℃，24h。取出小室，PBS洗滌2次，100%甲醇固定10min后PBS洗滌2次，結(jié)晶紫染色15min，用棉簽擦拭小室內(nèi)層的細(xì)胞，倒置顯微鏡下(×200)隨機(jī)計數(shù)5個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)，計算平均數(shù)。

1.6 肺癌動物模型的建立及CCR7、PI3K免疫組織化學(xué)檢測

取對數(shù)生長期的Luciferase-95D細(xì)胞制備成細(xì)胞懸液，分別于皮下注射1×106個細(xì)胞及尾靜脈注射 2×106個細(xì)胞，制備移植瘤和轉(zhuǎn)移瘤動物模型，待移植瘤直徑在0.5cm左右時(或尾靜脈接種2周后)，隨機(jī)分成對照組和Res組，每組6只，分別給予PBS和Res[100mg/(kg·d)-1]腹腔注射，5d為1個療程，共3個療程。治療結(jié)束后頸椎脫臼處死小鼠，取瘤組織進(jìn)行SABC免疫組織化學(xué)染色。主要流程如下: 切片脫蠟后經(jīng)3%H2O2孵育10min，正常血清封閉10min。CCR7、PI3K抗體孵育，4℃過夜。生物素化二抗室溫孵育20min后滴加SABC，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，水洗、封片，顯微鏡下觀察，陽性細(xì)胞呈棕色至棕褐。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)

2 結(jié) 果

2.1 Res對肺癌細(xì)胞CCR7表達(dá)的影響

2.1.1 熒光定量PCR測定結(jié)果 結(jié)果顯示Res處理組細(xì)胞CCR7的mRNA相對水平與對照組相比明顯降低(對照組與實驗組比值為1∶0.19)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示Res能夠顯著抑制CCR7的mRNA轉(zhuǎn)錄。

2.1.2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色測定結(jié)果 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色顯示CCR7定位于細(xì)胞質(zhì)和胞膜，經(jīng)過Res處理24h后，CCR7的表達(dá)水平隨Res濃度的升高而呈下降趨勢，40μmol/L以上作用顯著，呈現(xiàn)Res劑量依賴性，見圖1。

圖1 Res處理后95D細(xì)胞CCR7表達(dá)水平的變化Fig.1 The expression of CCR7 in 95D cells treated by resveratrolA： 0μmol/L; B： 20μmol/L; C： 40μmol/L; D： 80μmol/L; E： 120μmol/L

2.1.3 Western印跡法測定結(jié)果 Western印跡法結(jié)果與免疫組織化學(xué)染色結(jié)果一致，隨著Res濃度的增加，CCR7的表達(dá)降低，呈劑量依賴性。對照組、Res20、40、80、120μmol/L組的95D細(xì)胞CCR相對灰度值分別為1.03±0.08、0.92±0.10、0.85±0.21、0.74±0.05、0.5±0.01。與對照組相比，80、120μmol/L組CCR表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見圖2。

2.2 Res對肺癌細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

經(jīng)過不同濃度的藥物處理24h后，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞的侵襲能力(穿越Matrigel膠)及遷移能力(無Matrigel膠)逐漸降低，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少(表1、圖3～4)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且各組間也有明顯差別(P<0.05，P<0.01)，由此可見，白藜蘆醇可以抑制SLC作用下的細(xì)胞的侵襲，并呈濃度依賴性。

圖2 Res對95D細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)水平影響Fig.2 Effect of Res on CCR7 in 95D cells detected by Western blotting

2.3 Res對肺癌細(xì)胞PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)的影響

Western印跡法顯示，經(jīng)不同濃度Res處理后，細(xì)胞內(nèi)Akt表達(dá)無顯著變化，但PI3K和p-Akt表達(dá)均明顯降低，并呈現(xiàn)一定劑量依賴性，見圖5、表2。

表1 Res處理后穿膜細(xì)胞數(shù)的變化Tab.1 The number of cells penetrating the membrane after resveratrol treatment ±s)

與對照組相比較，*P<0.05；**P<0.01

圖3 Res對95D細(xì)胞的侵襲能力的影響Fig.3 The effect of resveratrol on invasion ability of 95D cellsA： 0μmol/L；B： 20μmol/L；C： 40μmol/L；D： 80μmol/L；E： 120μmol/L

圖4 Res對95D細(xì)胞的遷移能力的影響Fig.4 The effect of Resveratrol on migration ability of 95D cellsA： 0μmol/L；B： 20μmol/L；C： 40μmol/L；D： 80μmol/L；E： 120μmol/L表2 Res對p-Akt、PI3K灰度分析統(tǒng)計結(jié)果Tab.2 Image analysis of p-Akt and PI3K expression after treatment with resveratrol

±s)

與對照組相比，*P<0.05;**P<0.01

2.4 動物模型免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

裸鼠移植瘤石蠟切片免疫組織染色鏡下觀察結(jié)果顯示，對照組中CCR7分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，呈棕黃色或褐色顆粒狀強(qiáng)陽性表達(dá)；而實驗組中，經(jīng)過藥物處理后CCR7的表達(dá)降低，與細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果相吻合；PI3K主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，表達(dá)水平相對較低,見圖6。

圖5 Res對95D細(xì)胞Akt/p-Akt、PI3K表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Res on expression of Akt/p-Akt/PI3K in 95D cells detected by Western blotting

圖6 Res對肺癌移植瘤CCR7和PI3K表達(dá)的影響Fig.6 The effect of resveratrol on expression of CCR7 and PI3K in lung cancer xenografts

3 討 論

Res作為一種具有抗氧化，抗突變等多種生物學(xué)活性的天然醇類，已廣泛用于預(yù)防心血管疾病、動脈硬化等疾病中[8-9]。有研究表明Res可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性、抑制新生血管形成進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用[10-12]。

CCR7是機(jī)體免疫微環(huán)境中一個重要的核心因子，在T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及重要的抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)。次級SLC(又稱CCL21)是其高親和力配體[1-3,13]。CCR7與其配體結(jié)合后，可以通過其偶聯(lián)的G蛋白激活多種信號分子將信號傳入細(xì)胞內(nèi)，引起一系列細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)。SLC/CCR7信號傳遞主要是通過激發(fā)細(xì)胞內(nèi)PI3K和MAPK通路實現(xiàn)的[14]。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，因其結(jié)構(gòu)和功能的不同分為3類[15]。Akt是PI3K的下游靶點，其通過磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白如Caspase 9、MMPs等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及遷移。近年來發(fā)現(xiàn)PI3Ks/Akt信號通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，與腫瘤細(xì)胞的遷移、黏附、腫瘤血管生成以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等相關(guān)[16-20]，各種癌基因酪氨酸激酶受體，如Ras、Src等均可使其活化[21]，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有密切關(guān)系。

有研究提示Res可通過下調(diào)CCR7而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10]。本研究通過帶有Matrigel的Transwell實驗進(jìn)一步證實了Res可通過下調(diào)CCR7抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲。同時，實驗結(jié)果顯示Res能夠抑制95D細(xì)胞中PI3K/p-AKT表達(dá)，且體內(nèi)實體瘤結(jié)果與體外實驗吻合，提示Res可能通過抑制CCR7的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)PI3K/Akt信號通路的活性，抑制肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這為針對PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵分子為靶點的腫瘤治療提供了新的實驗依據(jù)，其確切機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

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Effect of chemokine receptor CCR7 down-regulation on invasion of lung cancer 95D cells

LIURen-peng，CHENGuo-ling，ZHOUShuang，TAOHui-hong，YANGYao-qin

(Cancer Institute, Tongji University School of Medicine, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the effect of down-regulation of CCR7 expression on the invasion and migration ability in lung cancer 95D cells. Methods Human lung cancer 95D cells were treated with different does of resveratrol. The expression of CCR7 and related signaling pathway proteins were assayed by immunofluorescence, Real-Time PCR and Western blotting, respectively. The cell invasion and migration ability were evaluated by Transwell assay. Results The expression of CCR7, PI3K, p-AKT protein in 95D cells were decreased in a dose-dependent manner after resveratrol treatment. Transwell array showed that invasion ability of 95D cells was inhibited with the decreasing of CCR7 expression, and cell migration induced by SLC also inhibited. Conclusion The results suggest that resveratrol can down-regulate expression of CCR7, PI3K and p-AKT, which might be involved in the inhibition of tumor cell invasion and metastasis, and enhance cell apoptosis.

CCR7; resveratrol; invasion; secondary lymphoid tissue chemokine; lung cancer

10.16118/j.1008-0392.2015.04.002

2015-01-01

國家自然科學(xué)基金(31000527)

劉仁鵬(1984—)，男，碩士研究生.E-mail: 2012rocpaul@#edu.cn

楊耀琴.E-mail： yaoqiny@163.com

R 734.2

A

1008-0392(2015)04-0007-06