季 瑋，江艷芬，陳 穎，陳春葉，梁 靜，朱愛(ài)萍

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·基礎(chǔ)研究·

依達(dá)拉奉對(duì)大鼠腦缺血再灌注后VEGF及Flk-1表達(dá)的影響

季 瑋1，江艷芬1，陳 穎2，陳春葉1，梁 靜1，朱愛(ài)萍1

(1.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院急診科，上海 200082；2.上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200082)

目的 探討依達(dá)拉奉對(duì)大鼠腦缺血再灌注后VEGF及Flk-1表達(dá)的影響。方法 將腦缺血再灌注模型制備成功的雄性SD大鼠64只隨機(jī)分成模型組、依達(dá)拉奉組,每組32只。試驗(yàn)后第2天，模型組予尾靜脈注射生理鹽水10ml/kg，依達(dá)拉奉組予依達(dá)拉奉3mg/kg，每日1次。在試驗(yàn)后第3、7、14、28天，兩組各處死8只大鼠，大鼠處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。RT-PCR法檢測(cè)紋狀體VEGF及其受體Flk-1mRNA表達(dá)水平，ELISA檢測(cè)紋狀體VEGF蛋白水平。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)后第7、14、28天，依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能缺失評(píng)分較模型組均顯著降低，VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量、Flk-1mRNA相對(duì)表達(dá)量、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組均顯著升高(均P<0.05)。依達(dá)拉奉組第7天神經(jīng)功能缺失評(píng)分低于第3天，第14天低于第7天(均P<0.05)。依達(dá)拉奉組第7天VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量、Flk-1mRNA相對(duì)表達(dá)量、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量高于第3天(均P<0.05)。結(jié)論 依達(dá)拉奉可改善腦缺血再灌注大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能，作用機(jī)制可能與促使紋狀體VEGF及Flk-1表達(dá)，保護(hù)腦神經(jīng)有關(guān)。

缺血再灌注；VEGF；Flk-1；依達(dá)拉奉

腦缺血再灌注損傷涵蓋臨床上許多疾病伴發(fā)的病理?yè)p害過(guò)程，它的進(jìn)程對(duì)原發(fā)性疾病的預(yù)后起決定性作用。目前,對(duì)腦缺血的治療研究主要集中在缺血半影區(qū)血供的改善及側(cè)支循環(huán)的建立[1]。本研究采用大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注的大鼠模型，觀察依達(dá)拉奉對(duì)動(dòng)物紋狀體區(qū)VEGF及其受體Flk-1表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化情況，借以闡明依達(dá)拉奉促進(jìn)腦缺血再灌注后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能改善的部分機(jī)制，為臨床指導(dǎo)缺血性卒中的治療提供新的思路和科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑

雄性SD大鼠80只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量180～220g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2007— 0005；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK(滬)2009— 0069。依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司；RNA抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；VEGF及其受體引物購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；SYBR Green PCR mix購(gòu)自Applied Biosystems公司；VEGF ELISA kit購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.2 模型制備與分組

采用隨機(jī)數(shù)字法，在80只SD大鼠中選取8只作為假手術(shù)組，其余72只為模型組。模型制備：取雄性SD大鼠，術(shù)前稱重，24%水合氯醛(350mg/kg)麻醉后仰臥固定，沿頸正中作約2cm長(zhǎng)皮膚切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。將一端加熱成圓珠狀(直徑<0.3mm)的尼龍線沿頸外動(dòng)脈、頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈向上插入前腦動(dòng)脈(約2cm)，再往回拉約2mm至大腦中動(dòng)脈起始部(從頸內(nèi)外動(dòng)脈分叉處計(jì)算插入約1.7cm)。2h后，將線栓拔退至頸外動(dòng)脈，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈的供血。假手術(shù)組僅切開(kāi)皮膚、分離右側(cè)頸總動(dòng)脈后即縫合。造模術(shù)中死亡3只，存活69只，動(dòng)物清醒后按相關(guān)文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)缺損表現(xiàn)；1分：對(duì)側(cè)前爪不能充分伸展；2分：向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能行走，意識(shí)喪失。1至3分者作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，0分和4分者剔除。合計(jì)剔除5只，即造模成功的大鼠64只。

將造模成功后存活的大鼠按上述方法分為模型組、依達(dá)拉奉組,每組32只。術(shù)后第2天，模型組予尾靜脈注射生理鹽水10ml/kg，依達(dá)拉奉組予依達(dá)拉奉3mg/kg，每日1次。在第3、7、14、28天，兩組各處死8只大鼠。動(dòng)物末次給藥后,處死前2h按前述方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)紋狀體VEGF 及其受體Flk-1mRNA表達(dá)水平

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總mRNA，然后以RT法合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參考PubMed中Gene bank檢索VEGF及其受體 mRNA序列，根據(jù)軟件Gene runner 3.0設(shè)計(jì)引物。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳、染色、電泳凝膠成像掃描，F(xiàn)luor Chen 2.0軟件分析測(cè)定擴(kuò)增條帶吸光度值，與GAPDH的吸光度比值作為mRNA相對(duì)表達(dá)量。VEGF上游引物：5′-CTGTACCTCCACCATG-CCAAG-3′，下游引物：5′-ACAAGGCTCACAGTG-AACGC-3′，擴(kuò)增片段469bp。VEGF受體(Flk-1)上游引物：5′-CCAATGAAGGGGAACTG-3′，下游引物：5′-TGACTGCTGGTGATGCT-3′，擴(kuò)增片段535bp。GNPDH上游引物：5′-ACCACAGTCCAT-GCCATCAC-3′，下游引物：5′-TCCACCACCCTGT-TGCTGTA-3′，擴(kuò)增片段452bp。

1.4 ELISA法檢測(cè)紋狀體VEGF水平

首先將紋狀體置于40倍的緩沖溶液中勻漿提取蛋白，離心取上清液。根據(jù)ELISA kit說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液VEGF含量，檢測(cè)時(shí)上清液稀釋2倍后檢測(cè)。結(jié)果以相對(duì)表達(dá)量表示，相對(duì)表達(dá)量即為：以假手術(shù)組動(dòng)物VEGF表達(dá)均值為1，其他組動(dòng)物VEGF表達(dá)水平與其的比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

實(shí)驗(yàn)前，模型組、依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能評(píng)分相近，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)后第7、14、28天，依達(dá)拉奉組神經(jīng)功能缺失評(píng)分較模型組均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.022、0.000、0.000，均<0.05)；依達(dá)拉奉組第7天神經(jīng)功能缺失評(píng)分低于第3天，第14天低于第7天，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別0.007、0.042，均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分Tab.1 Neural function defect scale at different time point in two groups

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血大鼠紋狀體VEGF及其受體Flk-1mRNA表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)后第7、14、28天，依達(dá)拉奉組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.030、0.000、0.021，均<0.05)；依達(dá)拉奉組第7天高于第3天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠紋狀體VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.2 Relative expression of VEGF mRNA in two groups

實(shí)驗(yàn)后第7、14、28天，依達(dá)拉奉組Flk-1mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000、0.000、0.000，均<0.05)；依達(dá)拉奉組第7天高于第3天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠紋狀體Flk-1mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.3 Relative expression of Flk-1 mRNA in two groups

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)腦缺血大鼠紋狀體VEGF蛋白表達(dá)水平的影響

實(shí)驗(yàn)后第7、14、28天，依達(dá)拉奉組VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.007、0.009、0.015，均<0.05)；依達(dá)拉奉組第7天高于第3天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 兩組大鼠紋狀體VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.4 Relative expression of protein VEGF in two groups

3 討 論

腦缺血再灌注大鼠模型制備有多種方法，選擇性阻斷大腦中動(dòng)脈與大腦中動(dòng)脈、后交通動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈均具有良好的重復(fù)性，但選擇性大腦中動(dòng)脈阻塞模型在24h內(nèi)梗死體積增加明顯，造成單側(cè)的包括基底節(jié)區(qū)、額葉、頂葉和顳葉皮層范圍的缺血，能較好地模擬腦缺血再灌注疾病狀況，是目前應(yīng)用較為成熟的腦缺血模型，目前多用于神經(jīng)保護(hù)藥物的研究。本實(shí)驗(yàn)造模過(guò)程中存活率為95.8%，造模成功率為92.8%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

本實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)果顯示腦缺血再灌注的大鼠模型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能受到明顯損傷，依達(dá)拉奉可以顯著改善上述損傷，但干預(yù)效果在7d以上方能顯現(xiàn)，且在7～28d內(nèi)，干預(yù)時(shí)間越長(zhǎng)，效果越顯著。本實(shí)驗(yàn)中從第7天開(kāi)始，依達(dá)拉奉組VEGF mRNA及VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組差異顯著，且較本組的第3天數(shù)值明顯上升，但第7、14、28天的數(shù)值之間差異不明顯，可能與VEGF的表達(dá)超過(guò)一定閾濃度后，無(wú)須明顯增加濃度，即可維持改善神經(jīng)功能的作用有關(guān)。

VEGF主要通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡與促血管再生起神經(jīng)保護(hù)作用[3]。在神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)下(如缺氧、葡萄糖缺失等)，VEGF作為內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡并刺激神經(jīng)再生，并通過(guò)增強(qiáng)血腦屏障對(duì)葡萄糖的通透性以及抗氧化等作用間接產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[4]。VEGF mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞外基層內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)部反應(yīng)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞向基層細(xì)胞的分化具有關(guān)鍵作用，是內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和增殖的決定因素[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，VEGF及其受體Flk-1可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活化。FIk-1(VEGFR-2) 是VEGF的兩種不同受體之一，屬酪氨酸激酶受體家族第Ⅲ亞型，其生物效應(yīng)是使細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，包括肌動(dòng)蛋白的改組，細(xì)胞膜皺縮，趨化性和促有絲分裂能力顯著改變[6]。正常大鼠腦中，VEGF的表達(dá)主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞，F(xiàn)lk-1主要在脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞表達(dá)，并且表達(dá)水平均很低[7]；在缺氧情況下，大鼠腦內(nèi)VEGF及受體的表達(dá)明顯增強(qiáng)，VEGF主要在膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，F(xiàn)lk-1伴缺血后血管形成，在血管內(nèi)皮細(xì)胞呈高表達(dá)[8]。

研究[9]發(fā)現(xiàn)，將外源性VEGF蛋白應(yīng)用于短暫性腦缺血大鼠腦表面，24h梗死體積縮小，腦水腫及神經(jīng)元損傷減輕，而內(nèi)皮細(xì)胞通常在缺血后數(shù)天才開(kāi)始增殖，說(shuō)明在血管形成之前，VEGF對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)起著直接保護(hù)作用，這有助于延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間，直到新血管形成。

本研究顯示，模型組與假手術(shù)組的VEGF與Flk-1mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異，可能與模型組的紋狀體樣本在術(shù)后3d處理有關(guān)。國(guó)外有關(guān)局灶性腦缺血大鼠模型試驗(yàn)[10]發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注4h時(shí)大腦皮層VEGF表達(dá)量顯著上升，并在8h達(dá)到峰值。而在同樣模型[11]下，缺血24h時(shí)與VEGF基因敲除大鼠相比，VEGF過(guò)表達(dá)大鼠大腦梗死體積減小20%，28d時(shí)減少33%。研究[12]顯示，在未經(jīng)藥物或其他人為因素干預(yù)的情況下，VEGF的過(guò)表達(dá)發(fā)生在腦缺血后24h內(nèi)，并在12h內(nèi)可達(dá)峰值，24h后表達(dá)水平緩慢下降，其對(duì)缺血損傷的保護(hù)作用可延續(xù)24～48h。VEGF的促血管生成功能是恢復(fù)缺血壞死區(qū)血循環(huán)的關(guān)鍵，也是神經(jīng)修復(fù)和再生的前提條件。腦血管閉塞后，缺血區(qū)毛細(xì)血管增生的范圍與程度直接關(guān)系到缺血邊緣區(qū)血流的改善，影響神經(jīng)元生理功能的恢復(fù)，從而決定機(jī)體神經(jīng)功能的改善程度[7]。VEGF及其受體的峰值在缺血缺氧后短時(shí)間出現(xiàn)，有利于VEGF誘導(dǎo)腦出血損傷區(qū)血管新生，從而重建血液循環(huán)，改善腦組織缺氧和營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)[8]。本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)1～3d內(nèi)VEGF與Flk-1mRNA，而第3d模型組與依達(dá)拉奉組的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷情況無(wú)明顯改善，可能與3d 內(nèi)VEGF的表達(dá)不足以顯著影響模型大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能有關(guān)。

依達(dá)拉奉相對(duì)分子質(zhì)量為174．20，血腦屏障的通透率為60%[13]，靜脈給藥后對(duì)于腦內(nèi)具有高度細(xì)胞毒性的羥基基團(tuán)清除效果良好[14]。 實(shí)驗(yàn)[15]表明，依達(dá)拉奉具有清除自由基抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用,能明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而減輕腦缺血和腦缺血引起的腦水腫及組織損傷,改善缺血后引起的神經(jīng)功能缺損，并且對(duì)遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡也有抑制作用。依達(dá)拉奉可以通過(guò)直接抑制凋亡相關(guān)蛋白，下調(diào)缺血半暗帶區(qū)腦組織Caspase-3蛋白的表達(dá)，減少凋亡前體物質(zhì)的產(chǎn)生。進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，減輕腦損傷，起到良好的神經(jīng)保護(hù)作用[16]。

目前，關(guān)于依達(dá)拉奉作用于VEGF及其受體的研究較少，本實(shí)驗(yàn)顯示依達(dá)拉奉可顯著干預(yù)大鼠模型的VEGF表達(dá)，且依達(dá)拉奉組的紋狀體FlK-1均有高表達(dá)，與VEGF的變化趨勢(shì)相一致，這提示VEGF的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)FlK-1途徑發(fā)揮作用的，與體外實(shí)驗(yàn)[17]的結(jié)果類似。

在起效時(shí)間上，依達(dá)拉奉組在干預(yù)7d后VEGF及其受體開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異，與不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分相符合，說(shuō)明其對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能與增加VEGF表達(dá)有關(guān)。同時(shí)，依達(dá)拉奉組的VEGF及其受體表達(dá)量卻并未隨時(shí)間的推移減少，28d治療組VEGF仍高表達(dá)。這說(shuō)明藥物治療可充分延長(zhǎng)分泌時(shí)間，增加分泌量。從組內(nèi)比較可知，干預(yù)7、14、28d的數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與7d后依達(dá)拉奉的在體內(nèi)的吸收分布與消除達(dá)到平衡，血藥濃度處于穩(wěn)定有關(guān)，可進(jìn)一步進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究明確。

綜上所述，依達(dá)拉奉可能促使紋狀體VEGF及Flk-1表達(dá)，保護(hù)腦神經(jīng)，改善腦缺血再灌注大鼠的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能。但前7d，其對(duì)VEGF和Flk-1作用效果并不明顯，這可能與依達(dá)拉奉在恢復(fù)期發(fā)揮主要功效有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)還存在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)評(píng)價(jià)方法單一、無(wú)紋狀體病理學(xué)觀察、樣本量較少、用藥時(shí)間不夠長(zhǎng)等缺點(diǎn)，應(yīng)在進(jìn)一步的研究中改善，從而明確依達(dá)拉奉的作用機(jī)制。

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Effect of edaravone on regeneration of neurons in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury

JIWei1,JIANGYan-fen1,CHENYing2,CHENChun-ye1,LIANGJing1,ZHUAi-ping1

(1.Dept.of Emergency, Shanghai TCM-Integrated Hospital，Shanghai 200082, China; 2.Dept.of Pharmacy, Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai 200082, China)

Objective To investigate the effect of edaravone on regeneration of neurons in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury.Methods Sixty-four male SD rats with cerebral ischemia/reperfusion injury were divided into edaravone group (n=32) and model group (n=32).On the 2ndday, rats in model group received intravenous injection of normal saline [10ml/(kg·d)] and rats in edaravone group received intravenous injection of edaravone [3mg/(kg·d)].At the 3rd, 7th, 14th, 28thdays, rats were sacrificed with 8 animals in each batch in both groups.Neural function defect scale was evaluated before sacrifice, and mRNA of VEGF and Flk-1 in corpus striatum was detected by RT-PCR, and VEGF protein was detected by ELISA.Results At the 7th, 14th, 28thday, neural function defect scale in edaravone group was significantly lower than that in model group.The expression of VEGF mRNA, Flk-1mRNA, and VEGF protein in corpus striatum of edaravone group was higher than that in model group.Neural function defect scale at d7 in edaravone group was lower than that at the 3rdand 14thdays, the expression of VEGF mRNA, Flk-1mRNA and VEGF protein in edaravone group at the 7thday was higher than that at the 3rdday.Conclusion Edaravone can improve function of motor nerve in rats after cerebral ischemia/reperfusion injury, which may be associated with the up-regulation of VEGF and Flk-1 expression in corpus striatum.

ischemia reperfusion; vascular endothelial growth factor; Flk-1; edaravone

10.16118/j.1008-0392.2015.05.010

2015-03-16

季 瑋(1971—)，女，副主任醫(yī)師，學(xué)士.E-mail：jiweiqxz@163.com

江艷芬.E-mail：jiang_yanfen@126.com

R 743

A

1008-0392(2015)05-0047-05