侯文婕，陳 靜，李文星，劉月華,2

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·基礎(chǔ)研究·

BMP-2控釋涂層對(duì)加力狀態(tài)下牙周膜干細(xì)胞成骨分化的影響

侯文婕1，陳 靜1，李文星1，劉月華1,2

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔生物醫(yī)學(xué)及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，上海 200072；2.上海市口腔病防治院，上海 200001)

目的 測(cè)試在加力狀態(tài)下，層層自組裝BMP-2控釋涂層的緩釋效果，并檢測(cè)其對(duì)牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSC)的成骨誘導(dǎo)作用。方法 通過(guò)層層自組裝技術(shù)在Flexcell加力六孔板上負(fù)載[(PAH/BMP-2)/PSS][COL/ALG]20涂層，利用ELISA檢測(cè)加力狀態(tài)下緩釋涂層21d內(nèi)釋放的BMP-2濃度；將4～6代PDLSCs種于預(yù)置BMP-2控釋涂層的BioFlex專(zhuān)用六孔培養(yǎng)板，置于FX-4000T加力系統(tǒng)中，加載動(dòng)態(tài)張應(yīng)力(10%形變牽張力，20Hz)，各組作用時(shí)間均為1h/次，3次/d，間隔4h加力，分別培養(yǎng)3、5、7d。對(duì)照組為非預(yù)置涂層添加BMP-2培養(yǎng)液(100ng/ml)的BioFlex板同條件下加力培養(yǎng)；使用用Real-Time PCR和Western印跡法分析PDLSCs在不同張應(yīng)力作用前后，其表型標(biāo)志Runx2, ALP和OCN在 mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化情況。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組加力3、5、7d后，Runx2、ALP和OCN標(biāo)志物mRNA與蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 [(PAH/BMP-2)PSS]/[COL/ALG]20涂層對(duì)hPDLSCs在加力狀態(tài)下成骨向分化能力具有顯著增強(qiáng)作用。

骨形態(tài)蛋白-2；緩釋涂層；加力狀態(tài)；牙周膜干細(xì)胞

層層自組裝技術(shù)是一種應(yīng)用廣泛的材料表面改性方法，該方法可通過(guò)形成納米尺度的超薄膜，調(diào)控生物分子負(fù)載的層數(shù)和種類(lèi)，實(shí)現(xiàn)生物分子的控釋?zhuān)诮M織工程領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

本研究采用層層自組裝技術(shù)制備BMP-2控釋納米涂層，構(gòu)建以膠原(colleagen, COL)和海藻酸鈉(alginate, ALG)作為控釋阻隔層的控釋系統(tǒng)，并將BMP-2控釋納米涂層自組裝到Flexcell專(zhuān)用加力六孔板的硅膠膜表面，研究加力狀態(tài)下，層層自組裝BMP-2控釋涂層的緩釋效果，并檢測(cè)其對(duì)牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament Stem cells, PDLSC)的成骨誘導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

a-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；膠原COL購(gòu)自法國(guó)Symatese公司；海藻酸鈉ALG購(gòu)自美國(guó)NovaMatrix公司；BMP-2、ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Bioflex加力板、FX-4000T張應(yīng)力加載系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Flexcell公司。

1.2 方法

1.2.1 PDLSC 細(xì)胞培養(yǎng)和接種 選擇無(wú)齲無(wú)炎癥的正畸減數(shù)牙，拔除后立即置于含雙抗和10%血清的α-MEM培養(yǎng)液中。刮取根中1/3的健康牙周膜，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約1周后有原代細(xì)胞爬出。

制備單細(xì)胞懸液吹勻，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度，種于96孔板，8～12h后鏡下觀察標(biāo)記單個(gè)細(xì)胞孔，待標(biāo)記孔克隆長(zhǎng)至孔底40%左右時(shí)，擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.2 Bioflex加力板上BMP-2控釋納米涂層的構(gòu)建 配制濃度為1mg/ml的PAH、PSS聚電解質(zhì)溶液，0.3mg/ml的COL、ALG水溶液。將帶正電荷的BMP-2溶液分散在上述PAH溶液中，BMP-2濃度為1μg/ml。用HCl調(diào)整pH值至6.5。將 (PAH/BMP-2)溶液以2ml/孔加入Bioflex六孔加力板浸潤(rùn)10min后，用去離子水潤(rùn)洗3次，再加入PSS溶液2ml/孔浸潤(rùn)10min，用去離子水洗滌，形成[(PAH/BMP-2)/PSS]的生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)涂層；加入2ml/孔帶正電荷的COL溶液中10min后，用去離子水潤(rùn)洗3次，再每孔加入2ml帶負(fù)電的ALG溶液浸潤(rùn)10min，用去離子水洗滌，形成[COL/ALG]的涂層結(jié)構(gòu)。再經(jīng)20次循環(huán)，在Bioflex加力板上形成[(PAH/BMP-2)/PSS]/[COL/ALG]20的超分子薄膜結(jié)構(gòu)，控釋BMP-2(圖1)。

圖1 [(PAH/BMP-2)/PSS]/[COL/ALG]20薄膜涂層示意圖Fig.1 The sketch of [(PAH/BMP-2)/PSS]/[COL/ALG]20 film

1.2.3 加力狀態(tài)下控釋涂層緩釋BMP-2的檢測(cè) 將上述方法構(gòu)建的附有BMP-2控釋納米涂層的Bioflex加力板置于 FX-4000T 加載系統(tǒng)中，加載相同形式的動(dòng)態(tài)張應(yīng)力(10%形變牽張力，2Hz)，各組作用時(shí)間均為1h/次，3次/d，每次加力間隔 4h。從加力的第1天起孔板內(nèi)加入2ml 0.01mmol/L PBS溶液，24h后收集全部液體并重新加入2ml的0.01mmol/LPBS溶液，持續(xù)收集21d。將上述收集的液體按照BMP-2試劑盒的操作說(shuō)明加樣后使用酶標(biāo)儀檢測(cè)21d內(nèi)BMP-2的溶解情況，并繪制成圖表。

1.2.4 PDLSCs加力培養(yǎng)和樣本收集 將PDLSCs分別接種到附有BMP-2控釋納米涂層的Bioflex加力板和無(wú)BMP-2控釋納米涂層的Bioflex加力板上，靜置48h等待細(xì)胞貼壁，在顯微鏡下觀察細(xì)胞已貼壁后，將兩組加力板置于FX-4000T 加載系統(tǒng)中，加載相同形式的動(dòng)態(tài)張應(yīng)力(10%形變牽張力，2Hz)，各組作用時(shí)間均為1h/次，3次/d，每次加力間隔4h。分別收集加力3、5、7d的細(xì)胞凍存、標(biāo)號(hào)，等待檢測(cè)。

1.2.5 熒光定量RT-PCR檢測(cè) 用TRIzol法分別提取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組加力3、5、7d后的牙周干細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢測(cè)runx2、ALP、OCN的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。

β-actin：上游引物為5′-CATTAAGGAGAAGC-TGTGCT-3′，下游引物為5′-GTTGAAGGTAGTT-TCGTGGA-3′；runx2：上游引物為5′-ACTTCCTG-TGCTCGGTGCTG-3′，下游引物為5′-TCGTTA-CCCGCCATGACAGT-3′；ALP：上游引物為5′-CAGTTGAGGAGGAGAACCCG-3′，下游引物為5′-GTAGACACCCCCATCCCATC-3′；OCN：上游引物為5′-GGAGCCCCAGTCCCCTACCC-3′，下游引物為5′-GCGCCGATAGGCCTCCTGAA-3′。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 2min；94℃ 10s，59℃ 10s，72℃ 40s，40個(gè)循環(huán)。取不同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western 印跡法檢測(cè)蛋白的表達(dá) 制作凝膠，取各個(gè)處理組蛋白提取液調(diào)整濃度，每孔中加上樣液20μg，留1孔加10μl預(yù)染Marker，恒壓電泳。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后室溫封閉。

孵育袋中加入TBST稀釋的Runx2 (1∶1000)、ALP (1∶1000)、OCN (1∶1000)和GAPDH (1∶2000)，孵育過(guò)夜，再加入二抗室溫孵育。膜與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑反應(yīng)，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 SPSS 20.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ELISA檢測(cè)加力狀態(tài)下BMP-2控釋涂層的緩釋曲線

BMP-2納米涂層能夠控釋BMP-2。第1～3天是突釋上升期，BMP-2的釋放濃度從(39±2.62) ng/ml快速增長(zhǎng)到(101±2.61) ng/ml；第3～15天，BMP-2的釋放處于穩(wěn)定平臺(tái)期，濃度在(87±7.25)～(107±4.01) ng/ml小幅度變化；第16～21天，BMP-2的釋放處于衰減期，濃度下降至(28±6.14) ng/ml，見(jiàn)圖2。

圖2 [(PAH/BMP-2)/PSS]/[COL/ALG]20涂層加力狀態(tài)下每日釋放量控釋曲線Fig.2 The daily release curve of [(PAH/BMP-2)/PSS]/[COL/ALG]20 film under mechanical force

2.2 Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果

不同加力時(shí)長(zhǎng)狀態(tài)下實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的標(biāo)志物 mRNA 的 RQ 值顯示，Runx2、ALP、OCN 的mRNA 水平隨時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，3、5、7d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在共同加力時(shí)長(zhǎng)狀態(tài)下，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在不同加力時(shí)常狀態(tài)下各標(biāo)志物mRNA的RQ 值見(jiàn)表1。

表1 各標(biāo)志物mRNA的RQ值Tab.1 The RQ value of Runx2, ALP and OCN mRNA

與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3 Western 印跡法檢測(cè)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞在3個(gè)加力時(shí)間段的Runx2蛋白水平表達(dá)均隨加力時(shí)間增加而呈上升趨勢(shì)，各加力時(shí)長(zhǎng)點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中加力5d時(shí)的Runx2表達(dá)量差異最大(圖3)。在加力3、5、7d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組ALP蛋白水平表達(dá)均隨加力時(shí)間增加而呈上升趨勢(shì)，各加力時(shí)長(zhǎng)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加力3、5、7d三個(gè)時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞變化趨勢(shì)相似，但是實(shí)驗(yàn)組的5、7d變化程度為更明顯(P<0.001)。對(duì)照組的3、5、7d呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組的3、5、7d呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖4)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的細(xì)胞在加力3、5、7d時(shí)間段的ALP蛋白水平表達(dá)均隨加力時(shí)間增加而呈上升趨勢(shì)，各加力時(shí)長(zhǎng)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。加力3、5、7d三個(gè)時(shí)間段，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞變化趨勢(shì)相似，但是實(shí)驗(yàn)組的5d與7d變化程度為更明顯(P<0.001)。對(duì)照組的3、5、7d呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，而實(shí)驗(yàn)組的3、5、7d呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)(圖5)。

圖3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞在加力3、5、7d時(shí)的Runx2蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of Runx2 protein in experiment and control groups under mechanical force for 3d, 5d and 7d

圖4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞在加力3、5、7d時(shí)的ALP蛋白表達(dá)Fig.4 The expression of protein ALP in experiment and control groups under mechanical force for 3d, 5d, 7d

圖5 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞在加力3、5、7d時(shí)的OCN蛋白表達(dá)Fig.5 The expression of OCN protein in experiment and control groups under mechanical force for 3d, 5d, 7d

3 討 論

機(jī)械應(yīng)力是能夠?qū)墙M織的形成和破壞吸收造成影響的重要因素。在正畸治療中，牙齒在矯治力作用下，圍繞牙根周?chē)难啦酃前l(fā)生應(yīng)力改建，繼而在矯治力的作用下產(chǎn)生牙移動(dòng)。 牙周膜復(fù)合體在牙周改建過(guò)程中具有重要作用，機(jī)械張應(yīng)力作用可牙周膜細(xì)胞成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)升高[1-2]。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)BMPs在促進(jìn)牙周干細(xì)胞成骨方面有著顯著的作用。在牙周相關(guān)的治療當(dāng)中，咀嚼力與正畸力都是不可忽視的重要影響因素，良好的生物材料應(yīng)該具有加力狀態(tài)下緩釋生物因子的性能。研究已經(jīng)證實(shí)(PAH/PSS)自組裝涂層可以控釋BMP-2，并誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。然而遺憾的是，目前尚未有加力狀態(tài)下，控釋涂層誘導(dǎo)PDLSCs成骨分化的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用的FX-4000T 加載系統(tǒng)，是由計(jì)算機(jī)控制的一種機(jī)械應(yīng)力加載裝置。其工作原理是將細(xì)胞種于底部是彈性硅膠膜的BioFlex培養(yǎng)板內(nèi)，通過(guò)真空壓力抻拉培養(yǎng)板底部的硅膠膜，可引起細(xì)胞的形變，從而為體外培養(yǎng)的細(xì)胞提供精確的、可控的、可重復(fù)的、靜態(tài)的或者周期性的應(yīng)力變化。目前，該裝置在體外細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用[3-4]。本研究在預(yù)置BMP-2控釋納米涂層的BioFlex加力六孔板(實(shí)驗(yàn)組)與標(biāo)準(zhǔn)BioFlex加力六孔板(對(duì)照組)上接種PDLSCs 并加載形式相同的牽張力，觀察牽張力作用3、5、7d時(shí)，PDLSCs 成骨相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)是否升高，進(jìn)而分析BMP-2控釋納米涂層在加力狀態(tài)下對(duì)PDLSCs成骨分化的影響作用。

為達(dá)到模擬牙周膜細(xì)胞在口腔內(nèi)承受的生理機(jī)械力(咀嚼力)的目的，通過(guò)分析以往有限元分析的數(shù)據(jù)資料得出，hPDLSCs施加最大形變10%的力較為適合[5]；通過(guò)比較文獻(xiàn)中牙周膜細(xì)胞應(yīng)力實(shí)驗(yàn)[3-5]的研究方法，設(shè)置本實(shí)驗(yàn)中牽張力加載的頻率為2Hz(即 0.5s 拉伸 0.5s 松弛)，每次加力1h，每天加力3次，間隔4h，持續(xù)時(shí)間分別為3、5、7d，收集樣本后采用Real-Time PCR和Western印跡法來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組hPDLSCs成骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化。

各成骨細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化與機(jī)械應(yīng)力加載的方式、時(shí)間有著密切的聯(lián)系。Runx2是一種與骨相關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在骨形成的各個(gè)階段均能夠發(fā)揮作用，特別是在間充質(zhì)細(xì)胞在向成骨細(xì)胞分化的初始階段當(dāng)中，起到了至關(guān)重要的作用[6]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Runx2的mRNA水平在3、5、7d三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)不斷升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Runx2蛋白水平的變化也得到了同樣的結(jié)果。由此可得出預(yù)置BMP-2控釋納米涂層的BioFlex加力六孔板(實(shí)驗(yàn)組)與標(biāo)準(zhǔn)BioFlex加力六孔板(對(duì)照組)上接種 PDLSCs并加載形式相同的牽張力，實(shí)驗(yàn)組Runx2的表達(dá)升高比對(duì)照組更為明顯。ALP是成骨細(xì)胞的另外一個(gè)重要標(biāo)志物，見(jiàn)于成熟的骨祖細(xì)胞、前成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。ALP的活性高低可以反映相應(yīng)細(xì)胞成骨方向轉(zhuǎn)化的大致趨勢(shì)，它與成骨細(xì)胞的分化、成熟呈正相關(guān)性[7]。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中PDLSCs中的 ALP 在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均隨時(shí)間而升高，且實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Runx2的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平在3、5、7d三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。OCN是成骨細(xì)胞合成并分泌的一種非膠原蛋白，為成骨細(xì)胞晚期的重要標(biāo)志物，一般認(rèn)為其表達(dá)受Runx2的調(diào)控，并會(huì)隨著Runx2的上升而上升。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組OCN的mRNA水平與蛋白水平隨時(shí)間變化都有不同程度的升高，且mRNA水平與蛋白水平在3、5、7d三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，5、7d時(shí)差異更明顯(P<0.001)。3d時(shí)，3組蛋白水平表達(dá)均有提升(P<0.05)，提示[COL/ALG]涂層可能有助于細(xì)胞在加力狀態(tài)下的早期黏附增殖。7d時(shí)，3組蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，提示緩釋涂層有利于BMP-2成骨誘導(dǎo)作用的發(fā)揮，在分化中后期依然可以起到顯著地促分化功效。

綜上所述，BMP-2涂層修飾組Runx2、ALP、OCN活性均顯著高于對(duì)照組，表明[(PAH/BMP-2)/PSS]/[COL/ALG]20涂層對(duì)PDLSCs的成骨分化能力具有顯著增強(qiáng)作用。

[1] Al-Nbaheen M, Vihnubalaji R, Ali D, et al.Human stromal (mesenchymal) stem cells from bone marrow, adipose tissue and skin exhibit differences in molecular phenotype and differentiation potential[J].Stem Cell Rev, 2013,9(1)：32-43.

[2] Han Y, Pan JS.Wang XL, et al.Cyclic strain promotes migration and proliferation of human periodontal ligament cell via PI3K signaling pathway[J].Cell Mol Bioeng, 2010,3(4)：369-375.

[3] Lee YH, Nahm DS, Jung YK, et al.Differential gene expression of periodontal ligament cells after loading of static compressive force[J].J Periodontol, 2007,78(3)：446-452.

[4] Nakao K, Goto T, Gunjigake KK, et al.Intermittent force induces high RANKL expression in human periodontal ligament cells[J].J Dent Res, 2007,86(7)：623-628.

[5] de Araujo RM, Oba Y, Moriyama K.Identification of genes related to mechanical stress in human periodontal ligament cells using microarray analysis[J].J Periodontal Res, 2007,42(1)：15-22.

[6] Garlet TP, Coelho U, Silva JS, et al.Cytokine expression pattern in compression and tension sides of the periodontal ligament during orthodontic tooth movement in humans[J].Eur J Oral Sci, 2007,115(5)：355-362.

[7] Alhashimi N, Frithiof L, Brudvik P, et al.Orthodontic movement induces high numbers of cells expressing IFN-gamma at mRNA and protein levels[J].J Interferon Cytokine Res, 2000,20(1)：7-12.

Effects of self-assemble BMP-2 controlled-release nano-film on osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells under mechanical force

HOUWen-jie1,CHENJing1,LIWen-xing1,LIUYue-hua1,2

(1.Laboratory of Oral Biomedical Science and Translational Medicine, Stomatology Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 2.Shanghai Stomatology Prevention and Treatment Center, Shanghai 200001, China)

Objective To assess the effect of self-assemble BMP-2 controlled-release nano-film on osteogenic differentiation of periodontal ligament Stem cells (PDLSCs) under mechanical force.Methods Bioflex Plates were coated with self-assembly [(PAH/BMP-2)/PSS][COL/ALG]20multi-layers modified nano-films, and then the delivery concentration of BMP-2 was detected by ELISA.The PDLSCs were cultured into six-well Bioflex Plates pre-coated with the multi-layers modified nano-films, and then placed in the Flexcell FX-4000T Tension Plus System.PDLSC were subjected to the distinct mechanical forces (10% static tension force, 20Hz, 1h×3/d, for 3d, 5d or 7d).Control cells were cultured in BioFlex plates with BMP-2 (100ng/ml) instead of BMP-2 nano-films.Then the expression of Runx2, ALP and OCN mRNA and protein was detected by Real-Time PCR and Western blot techniques, respectively.Results The expressions of Runx2, ALP and OCN mRNA and protein in BMP-2 nano-biofilm group were significantly higher than those in control group (P<0.05).Conclusion The BMP-2 controlled release nano-flim can significantly promote the osteoblast differentiation of hPDLSCs cultured under mechanical force.

BMP-2; controlled-release film; mechanical status; periodontal ligament Stem cells

10.16118/j.1008-0392.2015.05.006

2015-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金(81470768)

侯文婕(1989—)，女，碩士.E-mail：1989houwenjie@#edu.cn

劉月華.E-mail：liuyuehua@#edu.cn

R 781

A

1008-0392(2015)05-0029-05