吳 昊，相 俊，王 豐，李惠明，孫云燕，王炎秋,

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·基礎(chǔ)研究·

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及機(jī)制研究

吳 昊1，相 俊2，王 豐1，李惠明1，孫云燕1，王炎秋1,2

(1.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200080；2.同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065)

目的 分析囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)在人腫瘤組織中的表達(dá)特征，探討其臨床應(yīng)用價值。方法 采用甲基化特異性PCR檢測上皮性卵巢癌組織中CFTR甲基化發(fā)生率；采用免疫組織化學(xué)法檢測卵巢癌組織標(biāo)本及良性腫瘤組織中CFTR蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)與臨床病理分級的關(guān)系及CFTR對卵巢癌細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果 卵巢癌中 CFTR甲基化發(fā)生率大于50%，同時其蛋白表達(dá)明顯降低，且卵巢癌中CFTR的表達(dá)與卵巢癌的病理分級呈正相關(guān)性。CFTR去甲基化處理后，細(xì)胞凋亡增加。結(jié)論 CFTR在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用，可能成為新的腫瘤標(biāo)志物用于卵巢癌的早期診斷及對病情進(jìn)展的檢測。

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子；甲基化；免疫組織化學(xué)；上皮性卵巢腫瘤

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一，也是婦科腫瘤中病死率最高的疾病。卵巢癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖及轉(zhuǎn)移潛力，目前不僅缺少有效的早期篩查手段，而且對其惡性生物學(xué)行為機(jī)制尚不明確。近年來，表觀遺傳改變在上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用越來越受到重視，其中DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)機(jī)制研究最為深入的內(nèi)容[1- 3]。目前已知的卵巢上皮性癌特異性DNA甲基化狀態(tài)異常的基因多達(dá)數(shù)十個。

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種cAMP激活的氯離子通道，分布于具有分泌功能的上皮細(xì)胞中，介導(dǎo)跨上皮的離子轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌，并調(diào)控其他轉(zhuǎn)運(yùn)通路[4]。研究[4]分析了200例卵巢上皮性癌組織多基因的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)CFTR甲基化頻率大于50%(顯著高于Rassf1α及 BRCA1)，且表達(dá)水平明顯低于正常卵巢上皮組織。文獻(xiàn)[5-6]報道，CFTR基因改變可伴有上皮細(xì)胞癌變，其可作為抑癌或癌基因參與不同類型腫瘤的發(fā)生，如Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中檢測到高表達(dá)的CFTR，而高分化小肝癌中存在CFTR甲基化引起的表達(dá)缺失。因此，推測CFTR甲基化及表達(dá)降低是卵巢上皮癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制之一。本研究通過檢測CFTR甲基化發(fā)生及其在上皮性卵巢癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)，分析其與卵巢癌病理分期和分型的關(guān)系，探索其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

標(biāo)本來源于2007年1月至2013年12月上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的卵巢腫瘤手術(shù)治療患者，并簽署知情同意書。共選取60例卵巢癌患者的腫瘤組織標(biāo)本，患者年齡22～79歲，平均(54.2±14.5)歲。手術(shù)-病理分期(FIGO 2000年的標(biāo)準(zhǔn))結(jié)果如下：Ⅰ期18例，Ⅱ期14例，Ⅲ期28例；漿液性卵巢癌36例，黏液性卵巢癌6例；子宮內(nèi)膜樣癌12例；透明細(xì)胞癌6例。60例良性卵巢腫瘤患者組織作為對照。

1.2 CFTR基因的甲基化檢測

采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)方法，使用兩對引物(引物設(shè)計軟件：Methyl Primer Express v1.0)檢測CFTR基因的甲基化情況，并行亞硫酸氫鹽修飾后測序驗證。甲基化酶SssI轉(zhuǎn)化后的人類胎盤組織DNA作為陽性對照，健康成人淋巴細(xì)胞DNA作為陰性對照，去離子水作為空白對照。

反應(yīng)體系：ddH2O 19.5μl，10×PCR 緩沖液2.5μl，dNTP Mix 0.5μl，PCR Primer 0.5μl /0.5μl，Template(即DNA)1μl，rTaq 0.5μl，總體積25μl。反應(yīng)條件：94℃ 5min，40個循環(huán)；94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；72℃，10min。

1.3 免疫組化檢測

石蠟切片脫蠟，水化；PBS漂洗3次，每次3min；抗原微波修復(fù)。加入50μl新配置的0.3%H2O2甲醇，作為過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS漂洗3次，每次3min。加入50μl正常非免疫動物血清，室溫孵育10min以減少非特異性著色。加入50μl一抗CFTR(BS1525)抗體(美國Bioworld公司)，4℃過夜，PBS漂洗3次，每次3min。加入50 μl抗兔生物素化二抗[妙通(上海)生物科技有限公司]，室溫孵育10min，PBS漂洗3次，每次3min。加入1滴或50 μl鏈酶菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫孵育10min，PBS漂洗3次，每次3min。按照兔抗體免疫組化試劑盒[妙通(上海)生物科技有限公司]步驟操作：加入適量DAB，顯色5～10min，40倍顯微鏡 (YS100，日本Nikon公司)下觀察染色強(qiáng)度。蘇木精復(fù)染，返藍(lán)，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡 (Axioplan2，德國Zeiss公司)下觀察細(xì)胞著色比例。PBS代替一抗作為空白對照，正常子宮內(nèi)膜作為陰性對照[7]。

檢測結(jié)果判定：組織呈現(xiàn)黃色和棕黃色為陽性信號，細(xì)胞陽性反應(yīng)為胞漿或胞膜有棕黃色顆粒，根據(jù)組織顯色情況和細(xì)胞顯色比例進(jìn)行綜合評分。a：按組織顯色情況評分，無顯色，計0分；呈淺黃色或黃色，計1分；呈棕黃色，計2分；呈棕褐色，計3分。b：按細(xì)胞著色比例分級，著色<30%，計0分；著色30%～50%，計1分；著色50%～75%，計2分；著色>75%，計3分。根據(jù)(a+b)/2計算標(biāo)本積分。按積分高低分為：0分為陰性(-)，0.5～1分為弱陽性(+)，1.5～2分為中等陽性(++)，2.5～3分為強(qiáng)陽性(+++)[7]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)

人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910、SKOV-3、A2780種植于含10%胎牛血清的含酚紅的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞長至 70%～80%融合度時，胰酶消化傳代。實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.5 CFTR通路阻斷操作

采用5-雜氮-2′-脫氧胞苷(終濃度為10×10-6mol/L)去甲基化，使細(xì)胞的CFTR表達(dá)增加。使用不同濃度的CFTR通路阻斷劑CFTRinh-172降低卵巢癌細(xì)胞CFTR表達(dá)。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測

采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡(AnncxinV-PI 染色)。每孔接種 5×105個細(xì)胞于6孔板中，2ml 培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞。兩次離心后，加入300μl的 l×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。Annexin V-FITC 及PI 標(biāo)記，暗室溫孵育15min。 同時設(shè)置3個儀器調(diào)試管，體積為 300μl：(1) Mock組細(xì)胞，不加 PI 和 Annexinv-FITC；(2) Mock-PI 組細(xì)胞，加 PI 染液5μl，不加 AnnexinV-FITC；(3) Mock-FITC 組細(xì)胞，加5μl 的 Annexinv-FITC，不加稀釋的PI。每個樣品補(bǔ)加 200μl的 1×結(jié)合緩沖液至 500μl 終體積，輕輕混勻后上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件分析。計數(shù)資料采用秩和檢驗，其中多組比較用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較用Mann-Whitney檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢上皮性癌組織中CFTR基因甲基化發(fā)生頻率

對60例卵巢癌和60例正常卵巢組織進(jìn)行的腫瘤相關(guān)基因的DNA甲基化分析(DNA MS-PCR)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了2個高甲基化基因，而正常卵巢組織中未檢測到上述基因的甲基化。其中CFTR甲基化發(fā)生率為50.45%，卵巢癌敏感基因BRCA1甲基化發(fā)生率為40.89%。

2.2 CFTR蛋白在卵巢上皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中的表達(dá)

在卵巢良性腫瘤中，CFTR呈中等到強(qiáng)表達(dá)，而在上皮性卵巢癌中表達(dá)水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。在上皮性卵巢癌中，CFTR蛋白表達(dá)與不同組織學(xué)分型無相關(guān)性(表1、圖1)。CFTR在早期卵巢癌(Ⅰ期和Ⅱ期)中表達(dá)明顯降低，但仍顯著高于晚期(Ⅲ期)。

表1 CFTR蛋白在卵巢癌及良性卵巢腫瘤組織中的表達(dá)Tab.1 Expression of CFTR protein in ovarian tumor tissue chips and benign ovariantumor samples

與卵巢癌組(Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)相比，**P<0.01；與卵巢癌Ⅰ期、Ⅱ期相比，*P<0.5；與卵巢癌Ⅱ期相比，#P>0.05

2.3 上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中CFTR甲基化狀態(tài)

進(jìn)一步BSP克隆測序法驗證上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中CFTR甲基化狀態(tài)，結(jié)果提示，SKOV3細(xì)胞中CFTR呈高甲基化狀態(tài)(圖2)。

2.4 去甲基化及細(xì)胞凋亡

在上皮性卵巢癌細(xì)胞中，CFTR發(fā)揮抑癌基因的作用，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。5-Aza-dC去甲基化處理卵巢癌細(xì)胞，部分恢復(fù)CFTR的表達(dá)，從而增強(qiáng)其抑癌作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；CFTRinh-172則阻斷CFTR的表達(dá)，從而降低其抑癌作用，加速卵巢癌增殖，故其細(xì)胞凋亡率明顯下降(圖3)。

圖1 CFTR蛋白在卵巢癌及良性卵巢組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of CFTR protein in ovarian tumor tissue chips and benign ovarian tumor samples

圖2 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中CFTR甲基化狀態(tài)Fig.2 The methylation of CFTR in epithelial ovarian cancer cell line SKOV3

圖3 CFTR 表達(dá)與細(xì)胞凋亡Fig.3 The expression of CFTR and cell apoptosis

3 討 論

卵巢癌是女性生殖器官常見的三大惡性腫瘤之一，惡性度高，早期診斷困難，多數(shù)患者就診時已屬晚期，病死率居婦科惡性腫瘤首位。卵巢癌細(xì)胞具有高的增殖及轉(zhuǎn)移潛力,然而對其惡性生物學(xué)行為機(jī)制尚不明確。

癌癥包括卵巢癌是一受累于廣泛的表觀遺傳缺陷和遺傳缺陷的復(fù)雜疾病[1]。其中DNA甲基化是研究最為深入的表觀遺傳學(xué)機(jī)制[2]，其在診斷和治療的臨床實踐中有著重要的應(yīng)用前景，且已得到了充分的重視。在腫瘤細(xì)胞中，一些原本在正常細(xì)胞中處于低甲基化狀態(tài)的基因會發(fā)生高甲基化的狀態(tài)而轉(zhuǎn)錄失活，參與腫瘤性轉(zhuǎn)化。受累的基因包括抑癌基因、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期控制基因和抗凋亡基因等。對腫瘤臨床樣品(組織和體液性)中這類基因的DNA甲基化狀態(tài)分析在腫瘤臨床診斷中的巨大應(yīng)用前景已得到廣泛重視，開發(fā)以包括DNA甲基化在內(nèi)的新的生物標(biāo)志物以提高診斷和分期的準(zhǔn)確性及提出更合理的分型標(biāo)準(zhǔn)是當(dāng)今研究的熱點[5]。已發(fā)現(xiàn)的卵巢癌特異性DNA甲基化狀態(tài)異常的基因多達(dá)數(shù)十個[6]。本研究通過對卵巢癌組織標(biāo)本進(jìn)行甲基化分析，并與正常卵巢組織對比后，發(fā)現(xiàn)了高甲基化的抑癌基因BRCA1和CFTR。

文獻(xiàn)[6-8]報道，CFTR基因改變可伴有上皮細(xì)胞癌變，其可作為抑癌或癌基因參與不同類型腫瘤的發(fā)生，如Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中檢測到高表達(dá)的CFTR[9]，而高分化小肝癌中存在CFTR甲基化引起的表達(dá)缺失，腸癌和胰腺癌亦伴有CFTR的甲基化。本研究中發(fā)現(xiàn)卵巢癌中高甲基化(>50%)使CFTR蛋白表達(dá)降低，且隨著病理級別的升高，CFTR表達(dá)明顯下降，故推測CFTR在卵巢癌的發(fā)生及進(jìn)展中扮演抑癌基因的角色。

目前，CFTR與腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)系尚不清楚。本研究的細(xì)胞實驗結(jié)果提示，CFTR能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡。自噬性細(xì)胞死亡是除凋亡以外的另一種細(xì)胞程序性死亡的形式，可從細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)及血管生成等多個層面影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并抑制或協(xié)同促進(jìn)凋亡。Beclin1為自噬基因，其表達(dá)缺失可降低自噬活性。Beclin1的表達(dá)下調(diào)可能與卵巢癌的發(fā)生、進(jìn)展和臨床預(yù)后有關(guān)。ROS作為一個信號分子參與細(xì)胞的自噬性死亡。據(jù)報道，基因敲除或功能缺陷的CFTR可以通過ROS-TG2通路下調(diào)自噬基因Beclin1，而導(dǎo)致細(xì)胞增殖及腫瘤發(fā)生。故認(rèn)為，甲基化可能通過下調(diào)細(xì)胞自噬活性，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)移，并抑制凋亡[9-11]。本研究通過觀察自噬體的形成，檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3，探索CFTR調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制。

總之，上皮性卵巢癌中存在CFTR高甲基化，CFTR甲基化狀態(tài)與卵巢癌的發(fā)生和病理分級具有相關(guān)性，通過抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡發(fā)揮其抑癌作用。

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Expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in human epithelium ovarian cancer

WUHao1,XIANGJun2,WANGFeng1,LIHui-ming1,SUNYun-yan1,WANGYan-qiu1,2

(1.Dept.of Gynaecology and Obstetrics, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200080, China; 2.Dept.of Reproductive Medicine, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator CFTR in human ovarian tumor tissues and its clinical significance.Methods Immunohistochemistry was employed to detect the expression of CFTR protein in 60 ovarian tumor tissue chips and benign ovarian tumor samples.The relationship between the expression of CFTR protein and clinicopathoiogical characteristics was analyzed.Results There was higher methylation of CFTR occurring in ovarian cancer, accompanying with the lower expression of CFTR protein in the tumor tissues than that in non-tumor tissues (P<0.01)．Furthermore, the expression of CFTR was related to the pathological grades of ovarian cancer． The expression of CFTR in ovarian cancer tissues was lower in the late stage than that in early stage (P<0.05).While there was no significant difference between stage Ⅰ and stage Ⅱ.After treated with 5-Aza-dC the apoptosis of ovarian cancer cells was increased.Conclusion There is high methylation and low expression of CFTR protein in ovarian tumor tissues, which indicates that CFTR might be a tumor suppressor gene in tumor progression.

cystic fibrosis transmembrane conductance regulator；methylation；immunohistoche-mistry

10.16118/j.1008-0392.2015.05.004

2015-05-05

國家自然科學(xué)基金(81302254)；上海市衛(wèi)生局課題(20124114)

吳 昊(1977—)，女，主治醫(yī)師，碩士研究生.E-mail：zhuwy2007@126.com

王炎秋.E-mail：wangfan2002@126.com

R 71

A

1008-0392(2015)05-0018-05