周順萍，王 凱，徐亞偉

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·基礎(chǔ)研究·

肌肉因子irisin在舒張性心力衰竭大鼠中的表達及意義

周順萍，王 凱，徐亞偉

(同濟大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200072)

目的 通過建立大鼠壓力負荷誘導(dǎo)舒張性心力衰竭模型，探索新型肌肉因子irisin與舒張性心力衰竭(diastolic dysfunction，DHF)之間的聯(lián)系，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法 采用腹主動脈縮窄(abdominalaortic constriction，AAC)的手術(shù)方式建立壓力負荷誘導(dǎo)大鼠DHF的疾病模型。20只SD大鼠隨機分入AAC手術(shù)組(n=10)和假手術(shù)(sham)組(n=10)。造模12周后測量心超、心室內(nèi)壓力、解剖結(jié)構(gòu)評估造模效果。EILSA檢測irisin兩組間血清水平表達差異；利用Real-time PCR、Western印跡法、免疫組化染色分析irisin的剪切前體Ⅲ型纖維蛋白結(jié)構(gòu)域5(FNDC5)在兩組間表達差異，尋找irisin的分泌來源。結(jié)果 成功建立AAC-DHF的SD大鼠疾病模型。造模12周時，AAC組大鼠血清irisin水平逐漸升高，第12周時顯著高于Sham組[(135.2± 28.9) ng/mlvs(64.9±34.0) ng/ml，P<0.001]。Real-time PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)NDC5在AAC組的心臟組織(11.8±2.4vs1.88±1.2，P<0.001)和肌肉組織中表達較高(15.1±1.6vs1.25±1.4，P<0.001)。Western印跡法顯示，AAC組FNDC5在心臟表達高于Sham組(P=0.021)。IHC染色顯示，F(xiàn)NDC5主要表達于AAC組骨骼肌筋膜和心肌實質(zhì)。結(jié)論 大鼠AAC模型證實血清irisin水平在DHF的情況下升高，其來源可能是由心肌和骨骼肌共同分泌的。

irisin；舒張性心力衰竭；腹主動脈縮窄模型

心力衰竭作為心血管疾病發(fā)生發(fā)展的終末階段，嚴重影響心血管疾病患者的生存與生活質(zhì)量，造成巨大醫(yī)療負擔[1]。與收縮性心衰相比，舒張性心衰(diastolic heart failure，DHF)發(fā)生在正常心輸出量和正常射血分數(shù)的情況下[2]，故臨床重視不足，早期診斷困難，尚缺乏針對DHF的血清學(xué)標志物可輔助心功能的診斷。

研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，低強度運動可促進患者骨骼肌細胞膜上的Ⅲ型纖維蛋白結(jié)構(gòu)域5(fibronectin Ⅲ domain containing protein 5，F(xiàn)NDC5)剪切為細胞因子irisin，后者可在循環(huán)中被穩(wěn)定檢測。近期的研究[4-6]已證實irisin與心血管疾病間的關(guān)系密切，但尚缺乏疾病模型論證其臨床發(fā)現(xiàn)。本研究建立AAC-DHF大鼠疾病模型，動態(tài)觀察建模過程中irisin血清學(xué)變化，分析其與DHF之間的關(guān)系，并為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 模型建立

20只雄性SD大鼠體質(zhì)量180～200g，隨機分為2組。手術(shù)組：采用腹主動脈縮窄(Abdominal aortic constriction，AAC)模型[7-9]，10只為ACC組；10只為Sham組。ACC組用0.25%戊巴比妥麻醉后開腹，分離臟器與腹主動脈周圍脂肪，暴露腹主動脈0.5～1cm，置直徑0.3mm墊針，結(jié)扎腹主動脈后抽出墊針，關(guān)腹。Sham組的手術(shù)過程同AAC組，但不結(jié)扎腹主動脈。2組SD大鼠均持續(xù)腹主動脈結(jié)扎造模12周。造模期間予以正常飲水、飲食。

1.2 試劑

ELISA(EK-67-52)試劑盒購自Phoenix公司；反轉(zhuǎn)錄(PrimeScript RT reagent Kit)試劑盒購自TaKaRa公司；Real-Time PCR(Perfect Q-PCR Kit)試劑盒購自KAPA公司；FNDC5一抗(ab174833)試劑盒購自Abcam公司。

1.3 建模效果評估

1.3.1 超聲心動圖 于復(fù)旦大學(xué)生命工程實驗室小動物機能實驗中心進行超聲心動圖。主要測量指標有：舒張末左室后壁厚度(left ventricular posterior wall，LVPWd)、舒張末左室前壁厚度(left interventricular anterior wall，LVAWd)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension，LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic dimension，LVIDs)、左室短軸縮短率(fraction shortening，F(xiàn)S)、左室射血分數(shù)(ejection fraction，EF)。

1.3.2 血流動力學(xué)參數(shù)測定 使用小動物機能實驗平臺，經(jīng)大鼠主動脈內(nèi)測定大鼠血壓、心室內(nèi)壓力、最大左室壓力下降速率(-dp/dt)、最大左室壓力上升速率(+dp/dt)，解剖測定心臟重量指數(shù)及左心重量指數(shù)。

1.4 血清ELISA檢測

尾靜脈采集血樣，4℃，離心半徑9.4cm, 1000r/min，離心10min，分離上層血清，采用大鼠irisin ELISA試劑盒檢測irisin，具體操作步驟見說明書。

1.5 Real-Time PCR

使用TRIzol提取總RNA，總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA的按反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明進行操作，使用Real-Time PCR試劑盒檢測FNDC5表達水平，詳見試劑說明書。以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如下。FNDC5上游引物序列：5′-GCTGGGCTGCGT-GTGCT-3′，下游引物序列：5′-CATCCTTCTTCT-GCTGAGAG-3′；GAPDH的上游引物序列：5′-CCTGCCAAGTATGATGACATCA-3′，下游引物序列：5′-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3′。

1.6 Western印跡法

RIPA裂解液(RIPA、 PMSF、 Cocktail、磷酸酶抑制劑的混合液)冰上裂解組織，充分裂解后，4℃，離心半徑9.5cm，12000r/min，離心5min，吸取上清液。蛋白定量后加入6×上樣緩沖液煮沸。10%SDS-PAGE膠孔中加入等量蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂牛奶封閉后FNDC5一抗1∶800孵育過夜。TBST洗膜3次，1∶1000孵育二抗，成像系統(tǒng)Odyssey曝光成像。

1.7 免疫組化

取大鼠全心，去除上部心房及右室、骨骼肌，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片后行FNDC5蛋白免疫組化染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察攝片。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 AAC組與Sham組基本情況比較

實驗中共有20只SD大鼠，兩組大鼠術(shù)后均未出現(xiàn)相關(guān)手術(shù)并發(fā)癥，全部存活至第12周造模結(jié)束。術(shù)前，AAC組大鼠平均體質(zhì)量(115±1.67) g，Sham組大鼠平均體質(zhì)量(115±1.06) g，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后12周，AAC組大鼠體質(zhì)量為(547±8.89) g，Sham組大鼠體質(zhì)量為(548±8.46) g，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組大鼠術(shù)后飲水量較前有所增加，2周后恢復(fù)正常飲水量。

2.2 建模效果評價

兩組大鼠心超結(jié)果如圖1所示。AAC組大鼠LVIDs值大于Sham組(P<0.05)，LVPWd值大于Sham組(P<0.05)，AAC組大鼠FS值明顯延長(P<0.05)。

圖1 兩組大鼠心超結(jié)果Fig.1 Echocardiographic results of rats in two groupsA：心超圖像；B：心超測量心室結(jié)構(gòu)

2.3 兩組大鼠心臟結(jié)構(gòu)差異比較

造模12周時，兩組大鼠心內(nèi)導(dǎo)管測量結(jié)果顯示AAC組的動脈血壓值、+dp/dt值、-dp/dt值明顯高于Sham組(P<0.05)。兩組大鼠處死后觀察解剖學(xué)改變，AAC組大鼠的心臟總重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)和左心重量指數(shù)均大于Sham組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組大鼠心臟解剖參數(shù)比較Tab.1 Comparison of cardiac anatomic parameters in two groups

*P<0.05，**P<0.01

2.4 兩組大鼠血清irisin變化情況

在兩組大鼠給予手術(shù)后第12周，AAC組大鼠血清irisin水平升高，顯著高于Sham組[(135.2±28.9)ng/mlvs(64.9±34.0)ng/ml,P<0.01]。在腹主動脈結(jié)扎后第5周左右，AAC大鼠的血清irisin水平開始出現(xiàn)上升趨勢，而Sham組的血清irisin水平在12周內(nèi)處于平穩(wěn)狀態(tài)，未見明顯升高或降低(圖2)。

圖2 兩組大鼠術(shù)后12周血清irisin水平動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of serum irisin levels in two groups in 12 weeks after operation

2.5 FNDC5/irisin在AAC大鼠的心臟、骨骼肌中表達

與Sham組相比，irisin/FNDC5在AAC大鼠的心臟組織(11.8±2.4vs1.88±1.2，P<0.001)和肌肉組織(15.1±1.6vs1.25±1.4，P<0.001)中表達升高，見圖3A。Western 印跡法結(jié)果顯示，AAC大鼠心臟中irisin/FNDC5蛋白表達水平是Sham組(2.01±0.12)倍(P=0.021)，但這種差異在兩組大鼠骨骼肌中并不顯著，見圖3B。AAC大鼠的心臟、骨骼肌中irisin/FNDC5的染色陽性面積是Sham組的數(shù)2.37、5.62倍(P=0.003，P<0.001)，irisin染色陽性率顯著高于Sham組，見圖3C。骨骼肌橫縱斷面的光學(xué)顯微鏡(200×)下觀察顯示，irisin/FNDC5主要集中于骨骼肌肌筋膜表面表達。

圖3 FNDC5/irisin在兩組大鼠的心臟、骨骼肌中表達情況Fig.3 Expression of FNDC5/irisin in heart and skeletal muscle of two groups

3 討 論

通過近12周的造模，結(jié)果觀察手術(shù)組的大鼠血壓、心肌厚度、+dp/dt值、-dp/dt值明顯高于Sham組，說明成功建立DHF的大鼠模型。AAC組血清irisin水平手術(shù)后逐漸升高，與假手術(shù)對照組比，其水平差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。兩組RNA表達、蛋白表達以及免疫組化結(jié)果均證實irisin/FNDC5水平在AAC組大鼠的心臟和骨骼肌中的表達明顯增高，且心肌中的irisin/FNDC5表達水平高于骨骼肌。

在臨床中，由長期后負荷升高所導(dǎo)致的DHF占了整個疾病病因的大部分[10]。后負荷增加致使舒張末期外周血管壓力增加，心肌病理性肥厚而導(dǎo)致左心室順應(yīng)性降低，嚴重影響舒張早期的心室充盈能力。irisin作為一種新發(fā)現(xiàn)的細胞因子，已被證實可由肌細胞分泌[11]并參與肌肉收縮的能量代謝[12]。一項針對心衰患者的運動干預(yù)研究顯示，在低強度有氧運動的心衰患者中，可觀察到血清irisin水平增高，而不參加有氧運動的心衰患者中未見irisin水平的變化，并且血清irisin水平較高的患者有著更好的氧利用能力，提示irisin可能與心肌能量代謝存在某種聯(lián)系[3]。但目前的研究證據(jù)尚不充分。

本研究利用大鼠腹主動脈縮窄模型，建立了一個在壓力負荷下緩慢形成的心室肥厚的病理生理狀態(tài)，通過對手術(shù)組和Sham組血清irisin水平變化趨勢的觀察來探討irisin水平的升高或降低是否與心臟舒張功能狀態(tài)相關(guān)。本研究觀察到irisin水平隨著造模時間的增加而升高，通過RNA表達水平、蛋白水平和免疫組織化學(xué)染色說明Irisin的剪切前體FNDC5蛋白水平在手術(shù)組心肌、骨骼肌中顯著高于Sham組。在DHF的病理生理過程中，無論心肌肥厚還是充盈受限，均導(dǎo)致心肌細胞耗氧增加，自身供能不足，心肌細胞的正常生理活動發(fā)生障礙，進而導(dǎo)致心力衰竭等終末事件[13-14]，推測irisin可能是由心肌分泌的一種保護因子以加強自身能量代謝。

通過動物模型的動態(tài)觀察，本研究發(fā)現(xiàn)irisin作為一種新肌肉因子在DHF的疾病進程中進行性升高并且可能是由心肌和骨骼肌共同分泌的。雖然其在DHF中具體生物學(xué)作用尚有待進一步的研究闡明，但本研究提示Irisin/FNDC5與心臟舒張功能關(guān)系密切，可為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

大鼠AAC模型證實血清irisin水平在DHF 的情況下升高，其來源可能是由心肌和骨骼肌共同分泌的。

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Expression of myokine irisin in experimental model of diastolic heart failure

ZHOUShun-ping,WANGKai,XUYa-wei

(Dept.of Cardiology,Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To establish an after-load pressure induced rat model of heart diastolic dysfunction and to investigate its relationship with new myokine irisin.Methods The abdominal aortic constriction (AAC) was used to establish an animal model of pressure over-load induced diastolic dysfunction in rat.Twenty Sprague-Dawley (SD) rats were divided into AAC group (n=10) and sham group (n=10).Echocardiography, interventricular pressure, heart structure analysis were used to confirm the model.Q-PCR, Western blot and immunohistochemistry assays (IHC) were used to analyze the expression level of splice-precursor (FNDC5) of irisin.Results ELISA analysis showed that irisin level were significant higher in AAC group than that in sham group [(135.2±28.9) ng/mlvs(47.5±16.0) ng/ml,P<0.001].Q-PCR results showed that FNDC5mRNA relative expression level was higher in hypertrophic myocardium (11.8±2.4vs1.88±1.2，P<0.001) and skeletal muscle (15.1±1.6vs1.25±1.4，P<0.001) of AAC group than those of sham group.Western blotting results showed FNDC5 protein expression in myocardium of AAC group was higher than that of sham group (P=0.021).IHC result showed that the AAC rat had a significant higher FNDC5 protein IHC staining in skeletal muscle and cardiac muscle compared with sham group.Conclusion The SD rat model of AAC-DHF confirms that serum irisin level is increased in pressure-induced left ventricular diastolic dysfunction, and irisin may be produced by myocardium and skeletal muscle.

irisin; diastolic heart failure; abdominal aortic constriction model

10.16118/j.1008-0392.2015.05.003

2015-06-01

國家自然科學(xué)基金(81070107)

周順萍(1989—)，女，碩士.E-mail：zhou_1586@163.com

徐亞偉.E-mail：xuyawei@#edu.cn

R 541.6

A

1008-0392(2015)05-0013-05