張 潔，苗 偉，劉 暢，康志騫，李 麗，彭魯英

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·基礎(chǔ)研究·

丁酸鹽激活CaMKK促進緊密連接重組裝的研究

張 潔，苗 偉，劉 暢，康志騫，李 麗，彭魯英

(同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，上海 200092)

目的 探討丁酸鹽激活A(yù)MPK從而調(diào)節(jié)緊密連接的重組裝的途徑。方法 使用丁酸鹽、CaMKK特異抑制劑(STO-609)處理上皮屏障模型Caco-2細胞，在轉(zhuǎn)鈣過程中檢測電阻(TER)值、細胞內(nèi)ATP水平以及CaMKK和AMPK的磷酸化狀況，從而判斷丁酸鹽促進緊密連接重組裝的上游信號通路。結(jié)果 丁酸鹽處理Caco-2細胞后，其TER值顯著增高(P<0.05)，CaMKK和AMPK均被磷酸化激活，而上述作用可被STO-609部分減弱。結(jié)論 丁酸鹽可通過鈣離子途徑磷酸化激活CaMKK，繼而活化AMPK促進緊密連接的重組。

丁酸鹽；Caco-2細胞；緊密連接

腸上皮屏障既支持了水和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運，也阻擋了有害物質(zhì)對腸道的入侵，是維系機體正常消化系統(tǒng)功能的一重屏障。緊密連接(tight junction)是上皮細胞間最重要的連接方式之一，是維系正常上皮屏障功能基本的組分。多種因素可造成緊密連接組裝的松散甚至破壞，導(dǎo)致的細胞通透性異常通常是多種疾病的誘因或結(jié)果，如Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎等[1-3]。丁酸鹽(butyrate)是體內(nèi)菌群酵解膳食纖維等碳水化合物的產(chǎn)物，在維持腸上皮內(nèi)部穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[4-5]。研究[6]揭示：丁酸作為體內(nèi)自然代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸(SCFAs)，其鈉鹽可通過磷酸化的方式活化AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，進而促進緊密連接的組裝。丁酸鹽通過何種途徑激活A(yù)MPK而促進緊密連接分子組裝目前尚不清楚。AMPK是細胞內(nèi)的能量傳感器，是調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝以及蛋白質(zhì)合成的重要分子[7-8]。探索丁酸鹽如何激活A(yù)MPK而調(diào)節(jié)上皮屏障功能具有重要生物學(xué)意義。本研究利用經(jīng)典的屏障細胞模型，鑒定丁酸鹽刺激下激活A(yù)MPK的上游分子，闡明其上游信號通路，為相關(guān)腸道疾病的機理研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM、S-MEM、NEAA、L-Glu、胎牛血清、DMSO購自美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)皿、transwell及15、50ml刻度塑料離心管購自Corning公司；試劑butyrate、STO-609購自美國Sigma公司；AMPKα抗體、Phospho-AMPKα(Thr172)抗體、CaMKII抗體、Phospho-CaMKII (Tyr231)抗體購自CST公司；GAPDH抗體購自Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ATP檢測試劑盒、Western一抗二抗去除液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；上皮細胞電阻儀購自WPI公司；倒置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus公司；細胞培養(yǎng)箱、低溫離心機購自Thermo公司；酶標(biāo)儀、蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀器購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 Caco-2細胞培養(yǎng) Caco-2細胞(結(jié)腸腺癌細胞)購自中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。在培養(yǎng)皿中，置于含10%胎牛血清、1%雙抗、1%NEAA、1%L-Glu的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)條件下，每72h傳代一次。在使用鈣離子轉(zhuǎn)化策略處理細胞時，選取培養(yǎng)至細胞間90%以上融合的細胞，吸盡培養(yǎng)基并使用PBS漂洗3遍后，加入等量的S-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，16h后換回由DMEM配制的且加入了butyrate、STO-609的培養(yǎng)基。Transwell板培養(yǎng)時，將分化良好的Caco-2細胞接種于Transwell板上(孔徑0.4μm，有效面積0.33cm2)，隔天換液(Transwell上層加入100μl培養(yǎng)基，下層加入600μl培養(yǎng)基)。

1.2.2 跨上皮電阻的測定 在細胞生長過程中，按照時間節(jié)點使用上皮細胞電阻儀測定各組細胞的上皮電阻(transepithelial electrical resistance，TER)。為保證數(shù)據(jù)的準確性，重復(fù)測定3次，取平均值乘以Transwell膜面積，即為該樣品的TER值。

1.2.3 Western 印跡法檢測 向培養(yǎng)細胞中加入RIPA細胞裂解液(50mmol/L Tris，150mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，1%蛋白酶抑制劑，1%蛋白磷酸酶抑制劑)，冰上充分裂解后，4℃，離心半徑8.6cm，13000r/min，離心10min。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，后加入loading buffer置于95℃金屬浴加熱10min至蛋白變性。將蛋白樣品加入10%丙烯酰胺凝膠中，100V恒壓電泳90min，之后用濕轉(zhuǎn)法將膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，采用350mA恒流電泳120min。5%BSA封閉60min，加入一抗(1∶1000)搖床振蕩孵育60min后置于4℃冰箱過夜孵育。TBS/T溶液徹底漂洗后加入二抗(1∶2000)搖床振蕩孵育60min。最后，Thermo公司顯影液拍照后，用Image J軟件定量分析蛋白條帶。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 模型細胞內(nèi)ATP的檢測 利用ATP檢測試劑盒(S0026)檢測細胞內(nèi)ATP水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)運用SPSS 17統(tǒng)計軟件進行分析，每組樣本均為3例。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 butyrate處理后腸上皮屏障組裝情況及AMPK的磷酸化水平

為了驗證butyrate(2mmol/L)促進腸上皮細胞緊密連接重組裝的信號通路，將Caco-2細胞置于含鈣的DMEM培養(yǎng)基中，待電阻值達到150Ω/cm2以上后通過鈣離子轉(zhuǎn)換策略(calcium switch strategy)在S-MEM培養(yǎng)條件下進行撤鈣，16h后檢測到上皮細胞電阻值降低至50Ω/cm2以下，證實細胞間的緊密連接已呈去組裝狀態(tài)。在復(fù)鈣過程中，分別在0、2、4、6h觀察DMEM對照組和含2mmol/L butyrate DMEM條件下Caco-2單層細胞屏障功能的變化。結(jié)果顯示：從復(fù)鈣2h開始，使用Butyrate處理的實驗組，其上皮電阻TER值回升速度及程度明顯高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖1A)，提示butyrate可顯著促進Caco-2細胞屏障的恢復(fù)，從而在細胞功能層面驗證了其在緊密連接重組裝過程中的促進作用。

進一步使用Western 印跡法檢測了Caco-2細胞在復(fù)鈣0、2、4h三個時間點AMPK的磷酸化情況，結(jié)果如圖2所示。復(fù)鈣2、4h后，butyrate處理的實驗組細胞AMPK磷酸化水平顯著高于對照組，而AMPK的總蛋白沒有明顯變化(圖1B)。說明butyrate在促進Caco-2細胞緊密連接重組裝過程中AMPK被活化，提示butyrate激活A(yù)MPK介導(dǎo)緊密連接重組裝的潛在作用。

圖1 butyrate促進緊密連接重組裝并激活A(yù)MPKFig.1 Butyrate promotes tight junction reassembly and activates AMPKA：Caco-2細胞上皮電阻檢測；B：Western 印跡法檢測總AMPK、pAMPK的表達；Ctr：正常未處理的Caco-2細胞；BT：butyrate(2mmol/L)處理；GAPDH作為內(nèi)參

2.2 butyrate處理后細胞內(nèi)ATP水平及CaMKK的磷酸化水平

為了探究butyrate通過何種途徑激活A(yù)MPK，檢測了鈣離子轉(zhuǎn)化后Caco-2細胞內(nèi)ATP水平變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在復(fù)鈣0、2、4h后，butyrate并不能誘導(dǎo)細胞內(nèi)ATP水平的增加(圖2A)，提示butyrate并不通過調(diào)節(jié)ATP/AMP比值這條通路激活A(yù)MPK。

基于上述結(jié)果，進一步檢測butyrate是否通過激活鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶的激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase，CaMKK)進而活化AMPK。利用CaMKK特異抑制劑STO-609觀察對Caco-2細胞緊密連接的影響以及能否阻止butyrate的促組裝作用。結(jié)果顯示：在鈣轉(zhuǎn)2、4、6h后，STO-609(STO)組與對照組沒有明顯差別，但是降低了butyrate對電阻值的上調(diào)作用，提示STO-609不影響緊密連接的自動組裝過程，但是可以減弱butyrate(BT)對緊密連接組裝的促進作用(圖2B)。說明butyrate激活A(yù)MPK對上皮屏障功能的促進作用是依賴于CaMKK的介導(dǎo)。

在鈣轉(zhuǎn)復(fù)鈣4h后，進一步利用Western印跡法觀察了對CaMKK和AMPK的活化情況。實驗結(jié)果揭示：STO-609可以減弱butyrate對CaMKK以及AMPK磷酸化水平的上調(diào)作用(圖2C)，佐證了CaMKK介導(dǎo)了butyrate激活A(yù)MPK調(diào)節(jié)Caco-2細胞緊密連接重組裝的信號途徑。

圖2 butyrate激活CaMKK繼而激活A(yù)MPKFig.2 Butyrate regulates the activation of AMPK through the activation of CaMKKA：細胞內(nèi)ATP測定；B：上皮細胞電阻檢測 C：Western 印跡法檢測鈣轉(zhuǎn)4h后AMPK、CaMKK的磷酸化水平；Ctr：正常未處理的Caco-2細胞；BT：butyrate(2mmol/L)處理；STO：STO-609(5μg/ml)處理；GAPDH作為內(nèi)參

3 討 論

腸上皮屏障的健全對于機體正常生理功能的維持至關(guān)重要，其中緊密連接是其重要的組成部分。緊密連接由50余種蛋白組成，其中結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成了緊密連接的結(jié)構(gòu)骨架，主要有Occludin、Claudin、JAM等；功能蛋白連接細胞骨架以及膜蛋白，并傳遞信號，主要有ZO-1、ZO-2等[9]。緊密連接既可調(diào)控細胞的通透性，同時在細胞外環(huán)境和細胞內(nèi)之間進行著雙向信息傳遞，從而實現(xiàn)調(diào)控一些基因的表達以及細胞的生長等[10-11]。由于細胞通透性增加、結(jié)構(gòu)蛋白分子突變、異常調(diào)節(jié)信號所導(dǎo)致緊密連接的破壞常常是許多疾病的誘因或結(jié)果，其中包括NEC、Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎等。研究[12-13]顯示胞外Ca2+對于緊密連接的組裝和成熟十分必要。在Caco-2腸上皮屏障模型中，低濃度的細胞外鈣將破壞緊密連接的組裝，但當(dāng)恢復(fù)至高鈣濃度后，高細胞外鈣將重新召集緊密連接蛋白至胞膜處完成組裝重新行使功能。這個通過外鈣調(diào)節(jié)緊密連接組裝的方式被稱為“鈣離子轉(zhuǎn)換策略”[14]。

butyrate是一種腸道自身菌群通過無氧酵解而代謝產(chǎn)生的一種短鏈脂肪酸，同時也是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，具有參與基因表達調(diào)控、細胞分化、抗炎抗過敏、調(diào)節(jié)腸道屏障功能、作為能源為結(jié)腸細胞供能等多種功能，是維持腸道健康的重要因素[4]。Peng等[15]證實butyrate對腸道屏障的影響是雙重的，即：低濃度的butyrate有利于促進腸道屏障功能，高濃度butyrate可誘發(fā)嚴重的腸上皮細胞凋亡和破壞腸道屏障。因此本研究選取2mmol/L生理濃度的butyrate處理細胞，由此可以排除其對細胞產(chǎn)生的復(fù)雜效應(yīng)。在本研究中，利用鈣離子轉(zhuǎn)換策略，在低濃度細胞外Ca2+的培養(yǎng)環(huán)境下使得緊密連接解散，表現(xiàn)為細胞形態(tài)學(xué)改變以及細胞滲透力上升以及上皮電阻值持續(xù)下降，在恢復(fù)外鈣的同時加入藥理阻斷抑制劑，探討butyrate在緊密連接重組裝過程中通過何種途徑發(fā)揮作用。

本研究首先用生理濃度butyrate處理經(jīng)典的腸上皮屏障重組裝模型——經(jīng)鈣離子轉(zhuǎn)換策略復(fù)鈣后的Caco-2細胞，驗證了其對于重組裝過程的時間和效果上的促進作用，具體表現(xiàn)為實驗組上皮電阻TER值的顯著提高，接著使用Western印跡法證實了此過程伴隨有AMPK的磷酸化水平的上升，實驗結(jié)果與Peng等[6]的結(jié)果相吻合，即butyrate可通過磷酸化的方式激活A(yù)MPK，進而促進緊密連接的組裝。

為了探索butyrate在屏障重組裝過程中通過何種方式激活A(yù)MPK，本研究首先檢測細胞內(nèi)ATP的水平，發(fā)現(xiàn)鈣轉(zhuǎn)復(fù)鈣0、2、4h后，細胞內(nèi)ATP水平并無明顯變化。 AMPK是絲氨酸(蘇氨酸)激酶，當(dāng)AMP結(jié)合AMPK可導(dǎo)致172蘇氨酸被磷酸化，從而激活激酶，此過程主要由腫瘤抑制因子LKB1介導(dǎo)；而ATP與AMPK結(jié)合則可阻止其被激活[16]。Woods等[17]的研究證實，AMPK能夠被CaMKK激活，過表達CaMKKβ能激活A(yù)MPK，而使用CaMKK抑制劑幾乎廢除AMPK的活性；Hurley等[18]在3個細胞系上使用缺乏LKB1的細胞進行研究，證實CaMKK能夠激活缺乏LKB1細胞中的AMPK；Hawley等[19]的研究顯示，相比于 CaMKKα，CaMKKβ能更快地激活A(yù)MPK。同時，已有多種試劑能夠通過鈣離子調(diào)節(jié)的信號通路介導(dǎo)CaMKK激活A(yù)MPK：如Shen等[20]證實在C2C12細胞中使用ALA(alpha-Lipoic acid)，Stahmann等[21]證實在內(nèi)皮細胞中使用thrombin都能夠激活CaMKK從而激活A(yù)MPK。此外，在上述研究中使用選擇性抑制劑STO-609抑制CaMKK活性以及使用RNA干擾能夠沉默CaMKK，都能夠消除ALA、thrombin刺激引起的AMPK的激活。目前，已知AMPK激活有兩條途徑：(1) 細胞內(nèi)ATP水平降低所致的AMP/ATP比值上調(diào)而激活A(yù)MPK[22]；(2) 細胞內(nèi)Ca2+濃度上調(diào)，進而激活CaMKK，CaMKK再激活A(yù)MPK[18]。本研究結(jié)果揭示：butyrate在Caco-2細胞鈣轉(zhuǎn)實驗中并不影響細胞內(nèi)ATP水平的變化，據(jù)此推測可能由于butyrate影響了細胞內(nèi)鈣濃度的變化，進而激活CaMKK，并活化AMPK，從而促進Caco-2細胞緊密連接的重組裝，發(fā)揮維系細胞屏障的功能。

總之，在本研究中基于以往的工作基礎(chǔ)，利用生理濃度的butyrate(2mmol/L)刺激鈣離子轉(zhuǎn)化策略處理后的Caco-2細胞，驗證其對于腸道屏障重組裝的促進作用，從功能和生化水平分別證實了此過程是通過磷酸化CaMKK，激活A(yù)MPK，最終促進了緊密連接的重組裝過程。

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Butyrate facilitates tight junction reassembly via activation of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase

ZHANGJie,MIAOWei,LIUChang,KANGZhi-qian,LILi,PENGLu-ying

(Dept.of Pathology and Pathophysiology，Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the effect of butyrate on tight junction reassembly and related pathway.Methods The Caco-2 cell monolayer model was treated with butyrate and CaMKK inhibitor STO-609; then the transepithelial electrical resistance (TER), cellular ATP level, phosphorylated AMPK and CaMKK levels were measured.Results With the treatment of butyrate, the TER of Caco-2 cells significantly increased (P<0.05), phosphorylation of CaMKK and AMPK was increased; and those effects were partly abolished by STO-609.Conclusion Butyrate may regulate the activation of AMPK through phosphorylation of CaMKK, thus facilitate the reassembly of tight junction.

butyrate; Caco-2 cell; tight junction

10.16118/j.1008-0392.2015.05.002

2015-04-21

國家自然科學(xué)基金(31170791)

張 潔(1989—)，女，碩士.E-mail：zhj3867@163.com

彭魯英.E-mail：luyingpeng@#edu.cn

R 33

A

1008-0392(2015)05-0008-05