王 麗，范文斌，呂立夏，李 鵬，田海濱，徐國彤

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·基礎(chǔ)研究·

轉(zhuǎn)錄因子誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜色素上皮樣細胞的研究

王 麗1,2,3，范文斌1,2,3，呂立夏1,2,3，李 鵬1,2,3，田海濱1,2,3，徐國彤1,2,3

(1.同濟大學醫(yī)學院眼科研究所，上海 200092；2.同濟大學醫(yī)學院再生醫(yī)學系，上海 200092；3.同濟大學醫(yī)學院干細胞研究中心，上海 200092)

目的 探討采用關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子將人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)轉(zhuǎn)分化為視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)樣細胞的方法。方法 通過流式細胞技術(shù)鑒定hUC-MSCs的表面標記分子；通過誘導hUC-MSCs分化成為脂肪、骨和軟骨細胞確定其多系分化能力；采用慢病毒包裝系統(tǒng)獲得分別含有11個轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx、Mitf-A、Klf4和c-Myc的病毒，并通過感染hUC-MSCs來誘導hUC-MSCs向RPE樣細胞分化。結(jié)果 hUC-MSCs表達CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，但不表達CD11b、CD34, CD45和HLA-DR等分子標記，在成脂、成骨、成軟骨分化培養(yǎng)基中可分化為脂肪、骨和軟骨細胞。視網(wǎng)膜及RPE發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)UC-MSCs直接轉(zhuǎn)分化為RPE樣的細胞，并表達ZO-1、RPE65、Bestrophin-1(Best-1)、CK8/18、Cralbp、Mertk、Tyrosinase(Tyr)、PEDF等RPE細胞的特征分子。結(jié)論 視網(wǎng)膜及RPE發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子可直接將hUC-MSCs分化為RPE樣細胞。

人臍帶間充質(zhì)干細胞；視網(wǎng)膜色素上皮細胞；視網(wǎng)膜變性疾病

視網(wǎng)膜變性疾病(retinal degeneration, RD)以視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa, RP)和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)兩類最具代表性。這些疾病都以視網(wǎng)膜光感受器細胞和RPE功能喪失而引起視功能損害為共同表現(xiàn)。近年來，隨著干細胞研究的深入和干細胞技術(shù)的發(fā)展，基于干細胞的細胞移植治療為RD患者帶來了新的希望[1]。hUC-MSCs具有很強的增殖及自我更新能力，且能夠分化為骨、軟骨、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞和心肌細胞等多種類型的細胞[2-3]，因而hUC-MSCs有望廣泛應用于臨床。研究[4]表明，hUC-MSCs被移植到遺傳性RD模型RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后，表現(xiàn)出很強的神經(jīng)保護作用，但未發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs分化為視網(wǎng)膜細胞。最近的研究[5]發(fā)現(xiàn)，在皮膚成纖維細胞中過表達眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子(eye field transcription factors，EFTFs)可有效誘導RPE細胞的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，本研究采用不同的轉(zhuǎn)錄因子，探討將hUC-MSCs轉(zhuǎn)分化為RPE樣細胞，從而高表達RPE細胞特異性的標志基因。

1 材料與方法

1.1 材料

hUC-MSCs來源于華東干細胞庫。DMEM/F12培養(yǎng)基、TRIzol、胎牛血清(FBS)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白復合物(ITS)和胰蛋白酶購自Gibco公司；地塞米松、胰島素、3-異丁基1-甲基-黃嘌呤、吲哚美辛、 β-甘油磷酸、抗壞血酸、油紅、甲苯胺藍和茜素紅購自Sigma公司；人重組骨形成蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein, rhBMP-2)購自HumanZyme公司；細胞培養(yǎng)皿和細胞培養(yǎng)板購自Corning公司。熒光標記的抗Isotype control、CD105、CD90、CD73、CD44、CD29、CD11b、CD34、CD45和HLA-DR購自BD公司；抗RPE65、Bestrophin-1、ZO-1和Cralbp抗體購自Proteintech公司；Sox2、c-Myc和Klf4質(zhì)粒購自Addgene公司；限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購自NEB公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；Q-PCR試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；引物由上海生物工程有限公司合成，序列見表1。

表1 Q-PCR引物序列Tab.1 Primers for Q-PCR

(續(xù)表1)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及流式細胞技術(shù)鑒定hUC-MSCs表面標記分子 將hUC-MSCs培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)液并添加10% FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。當細胞達到80%融合時，采用胰酶消化細胞，收集并離心。同適量的抗體冰上孵育30min，采用流式細胞儀進行分析。

1.2.2 hUC-MSCs成脂、成軟骨和成骨分化能力的鑒定 將細胞接種于6孔板中(1×105/孔)，加入成脂誘導培養(yǎng)基(DMEM/F12，含10% FBS、 10-7mol/L地塞米松、10μg/ml胰島素、100μmol/L 3-異丁基1-甲基-黃嘌呤、100μmol/L吲哚美辛)，每2d換1次培養(yǎng)基。28d以后，細胞用4%的多聚甲醛固定，油紅染色。軟骨分化時，將1×106細胞接種于3.5cm的細菌培養(yǎng)皿里。細胞形成懸球，用成軟骨培養(yǎng)基(DMEM/F12含10% FBS、10μg/L轉(zhuǎn)化生長因子β1、50mg/L抗壞血酸和50g/L ITS)誘導28d后，將獲得的細胞懸球用多聚甲醛固定后冰凍切片，用甲苯胺藍染色鑒定軟骨細胞的形成。成骨分化時加入成骨誘導培養(yǎng)基(DMEM/F12，含10% FBS、10mmol/L β-甘油磷酸、50μmol/L抗壞血酸和20ng/ml BMP-2)，每2d換1次培養(yǎng)液。7d以后，用堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)染色檢測成骨能力；21d以后，采用茜素紅染色進一步鑒定成骨細胞。

1.2.3 慢病毒載體的構(gòu)建 從人胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)分化產(chǎn)物中提取mRNA為模板，采用PCR方法擴增出8個與視網(wǎng)膜發(fā)育及RPE細胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx和Mitf-A；另外購得3種在成熟RPE細胞中高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子質(zhì)粒Sox2、c-Myc和Klf4。將基因連接入載體pMXs中，從而構(gòu)建了11個視網(wǎng)膜及RPE發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體。

1.2.4 慢病毒的包裝 HEK293T細胞接種到10cm的細胞培養(yǎng)皿中，用DMEM(含4.5g/L葡萄糖)添加10% FBS、100U/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素培養(yǎng)細胞，達到70%融合時，將10μg連接有轉(zhuǎn)錄因子的載體質(zhì)粒、7.5μg包裝質(zhì)粒pMXs-VSVG、3μg包裝質(zhì)粒pMXs-G/P用LipofectAMINE2000 轉(zhuǎn)染進HEK293細胞中，4h以后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。60h后，收集培液上清液，并用0.45μm PVDF膜過濾，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 hUC-MSCs轉(zhuǎn)分化 hUC-MSCs接種到10cm的細胞培養(yǎng)皿中，當細胞密度達到30%～50%時進行病毒感染。感染時撤掉培養(yǎng)液，等比例加入含有11個轉(zhuǎn)錄因子病毒的病毒液，每種轉(zhuǎn)錄因子病毒液各加入2ml，并加入終濃度為8μg/ml polyb-rene；12h后撤掉病毒液，換成新鮮培養(yǎng)液。此后每天換液并觀察細胞形態(tài)的變化。

1.2.6 Q-PCR檢測轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)錄因子和RPE細胞特異性基因的表達 細胞經(jīng)TRIzol裂解后提取總RNA，用PrimeScript?RT Master Mix進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Q-PCR反應試劑盒采用SuperReal-PreMix Plus 并經(jīng)Bio-Rad CFX Manager 2.1 Detec-tion system 檢測，Gapdh作為內(nèi)參。

1.2.7 免疫熒光檢測感染細胞中RPE細胞特異蛋白表達 細胞接種于預置在培養(yǎng)皿中的玻片上，待細胞貼壁達到80%融合后，取出玻片。經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.1% TritonX-100透膜后，用抗人ZO-1、RPE65、Bestrophin-1、Cralbp等一抗以及相應種屬來源的帶CY3標記的二抗孵育；細胞核用DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 Western 印跡法檢測轉(zhuǎn)染細胞中RPE細胞特異蛋白的表達 用RIPA裂解液裂解細胞，提取蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳。用抗人RPE65、Bestrophin-1、ZO-1、Cralbp等一抗體以及相應種屬來源HRP標記的二抗檢測相關(guān)蛋白的表達。以β-actin作為對照內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 hUC-MSCs的鑒定

hUC-MSCs細胞呈成纖維細胞樣形態(tài)，經(jīng)流式細胞技術(shù)鑒定，hUC-MSCs表達CD29、CD44、CD73、CD90和CD105等MSC表面標記分子，但是不表達CD11b、CD34、CD45等血細胞表面標記分子和HLA-DR(圖1)。hUC-MSCs在成脂誘導分化4周后，細胞中出現(xiàn)許多細小的脂滴，能被油紅染成紅色，說明hUC-MSCs能夠被誘導分化為脂肪細胞(圖2A)。hUC-MSCs成軟骨培養(yǎng)細胞會相互聚集成球，培養(yǎng)28d以后，甲苯胺藍染色呈藍紫色(圖2B)。hUC-MSCs在成骨培養(yǎng)7d后，細胞高表達AKP，染色呈藍色(圖2C)，成骨培養(yǎng)21d后，能形成鈣結(jié)節(jié)組織，茜素紅染色后呈紅色(圖2D)，表明其具有成骨分化能力。以上結(jié)果顯示，hUC-MSCs具有MSC的基本特征及多系分化潛能。

圖1 人臍帶間充質(zhì)干細胞表面標記分子的檢測Fig.1 Analysis of surface markers of hUC-MSCs

圖2 人臍帶間充質(zhì)干細胞成脂、成軟骨、成骨分化能力的鑒定Fig.2 Dentification of the surface markers and multi-lineage differentiation potentials of hUC-MSCs

2.2 慢病毒載體的構(gòu)建

利用PCR的方法獲得了Pax6、Rax、Six6、Nr2e1、Otx2、Lhx2、Crx和Mitf-A共8種與視網(wǎng)膜發(fā)育和RPE分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的完整編碼序列的DNA片段，并將它們與Sox2、Klf4和c-Myc的DNA片段分別克隆到酶切后的載體pMXs中。經(jīng)雙酶切鑒定(圖3A)，確認構(gòu)建了11種不同轉(zhuǎn)錄因子的載體質(zhì)粒。用lipofectAMINE2000進行病毒包裝后，轉(zhuǎn)染hUC-MSCs。病毒感染7d后，hUC-MSCs中出現(xiàn)了RPE細胞形態(tài)樣的克隆，呈上皮樣，多邊形，有清晰可見的細胞間連接(圖3B)。

2.3 轉(zhuǎn)染后細胞表達RPE細胞相關(guān)特異性基因及蛋白

Q-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與hUC-MSCs相比，轉(zhuǎn)染后的細胞高表達轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Sox2、Pax6、Nr2e1、Six6、Lhx2、Mitf-A、Otx2和Crx(圖4A)，說明這8種轉(zhuǎn)錄因子可能與hUC-MSCs轉(zhuǎn)分化為RPE相關(guān)。轉(zhuǎn)染后細胞中的ZO-1、Bestrophin-1、Cralbp、RPE65、Mertk、Tyrosinase、PEDF、CK8/18等一系列直接與視黃醛代謝、黑色素合成以及吞噬相關(guān)的RPE細胞特異性基因表達量顯著性升高(圖4B)。免疫熒光染色結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染后的細胞呈ZO-1、RPE65、Bestrophin-1和Cralbp染色陽性(圖4C)。Western印跡法檢測進一步驗證了免疫熒光的結(jié)果，RPE細胞特異性蛋白在hUC-MSCs中幾乎不表達，而在轉(zhuǎn)染后的細胞中顯著升高(圖4D)。結(jié)果證明8種轉(zhuǎn)錄因子組合能夠使hUC-MSCs轉(zhuǎn)分化為RPE樣的細胞。

圖3 慢病毒載體的構(gòu)建以及病毒轉(zhuǎn)染后得到的細胞克隆形態(tài)Fig.3 Construction of lentiviral vector and the morphology of cell colony after transfectionA：雙酶切鑒定；B：hUC-MSCs轉(zhuǎn)染前后的形態(tài)

圖4 轉(zhuǎn)染后的細胞中轉(zhuǎn)入的轉(zhuǎn)錄因子和RPE細胞特異性基因和蛋白表達水平的檢測Fig.4 Analysis of the mRNA and protein levels of 11 transcription factors and RPE-specic markers in transfected hUC-MSCsA：轉(zhuǎn)錄因子的表達；B：RPE細胞特異性基因的表達；C：轉(zhuǎn)染后的hUC-MSC免疫組織學染色；D：RPE細胞特異性蛋白的表達；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

3 討 論

近年來，隨著人們對干細胞研究的深入，以干細胞移植為手段來治療視網(wǎng)膜變性疾病給人們帶來了新的希望。該治療策略的主要依據(jù)是RP及AMD的內(nèi)層神經(jīng)元環(huán)路仍然保持完整，因此，有可能通過干細胞移植再生修復光感受器細胞和(或)RPE細胞以恢復視功能。研究[6]表明，視網(wǎng)膜細胞、成體干細胞及ESC和誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)來源的細胞均可作為供體細胞用于治療RD。視網(wǎng)膜組織細胞作為已分化細胞，不僅材料獲得困難，而且治療效果也不理想。ESC和iPSC來源的供體細胞已分別在美國和日本進行初步的臨床試驗，但其成瘤性的安全隱患及治療效果仍在深入研究確認中。其中，ESC來源的細胞更有倫理和免疫排斥的障礙。相比之下，hUC-MSCs作為間充質(zhì)干細胞，來源廣泛，易于獲得，且具有多向分化能力和強大的旁分泌作用，可以成為治療RD的優(yōu)質(zhì)供體細胞[7-9]。理論上講，hUC-MSCs作為成體干細胞，安全性應該不存在問題，也沒有倫理上的爭議。

細胞(干細胞)移植治療的機制主要包括直接的細胞替代和分泌細胞因子所產(chǎn)生的間接作用。在RD晚期階段，當宿主視網(wǎng)膜的光感受器細胞或RPE細胞已經(jīng)衰亡時，移植的供體細胞能否分化為并替代受損傷的視網(wǎng)膜細胞則是干細胞移植治療RD的重要問題。研究[10-11]表明，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植到體內(nèi)后具有分化為光感受器細胞和RPE細胞的能力。本研究將大鼠BMSCs移植到碘酸鈉誘導的大鼠RD模型中，發(fā)現(xiàn)BMSCs能夠整合到RPE細胞層。將BMSCs移植到視網(wǎng)膜機械損傷的小鼠玻璃體腔后，供體細胞能在視網(wǎng)膜中整合并向視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞分化[12]。但也有報道將人BMSCs移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔后，雖然能明顯減慢光感受器細胞凋亡速度并抑制外核層的丟失，但未發(fā)現(xiàn)BMSCs分化為光感受器細胞或RPE細胞[8]；將小鼠BMSCs移植到RCS大鼠視網(wǎng)膜下腔也具有明顯的神經(jīng)保護作用，BMSCs能在視網(wǎng)膜下腔存活，但也未見整合及分化成光感受器細胞[13]。將UC-MSCs移植到RCS大鼠，雖然起到很強的光感受器細胞保護功能，但未發(fā)現(xiàn)UC-MSCs能夠分化成神經(jīng)元細胞[4]。以上研究結(jié)果的差異可能與MSC的異質(zhì)性及各實驗室所用的不同動物模型有關(guān)。但至少說明直接移植MSCs，細胞在受體視網(wǎng)膜中不易轉(zhuǎn)分化為RPE細胞或其他視網(wǎng)膜細胞。

胚胎發(fā)育早期階段，眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子Rax、Pax6、Six3、six6和Lhx2等決定著視網(wǎng)膜的早期發(fā)育[14-15]。Rax突變可導致胚胎無眼；Pax6基因突變導致RPE轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜；而Six3發(fā)生突變可導致神經(jīng)視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)分化為RPE細胞；Lhx2調(diào)節(jié)Mitf和Vsx2的表達，該基因缺失，眼睛發(fā)育停滯在視泡階段。此外，其他與眼發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Otx2在眼睛發(fā)育的早期階段就已出現(xiàn)，它們可以調(diào)節(jié)Rax的表達。Mitf和Otx2是視杯發(fā)育階段RPE分化成熟的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。缺失Mitf會導致RPE細胞分化成熟受阻，出現(xiàn)小眼或無眼癥狀。Yamanaka因子中的c-Myc和Klf4在成熟RPE細胞中高表達，可能與RPE細胞發(fā)育相關(guān)[16]。研究表明，將8個轉(zhuǎn)錄因子c-Myc、Klf4、Nrl、Crx、Rax、Pax6、Mitf和Otx2轉(zhuǎn)入人皮膚成纖維細胞中可將細胞轉(zhuǎn)分化為RPE細胞，但RPE細胞特異性的基因RPE65及Tyr表達量較弱，而本研究采用11個轉(zhuǎn)錄因子的組合轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，則可獲得高表達RPE細胞特異性基因的細胞克隆。此結(jié)果說明本研究采用的轉(zhuǎn)錄因子組合更易將間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化為RPE樣細胞。另一方面，hUC-MSCs可能干性更強，更利于轉(zhuǎn)分化為RPE樣細胞。然而，本研究采用了11個轉(zhuǎn)錄因子感染hUC-MSCs時，只有8個轉(zhuǎn)錄因子表達量顯著升高，仍需要進一步的實驗驗證其他轉(zhuǎn)錄因子的組合是否能更有效地將hUC-MSCs轉(zhuǎn)分化為RPE樣細胞。

綜上所述，hUC-MSCs能夠在體外被直接轉(zhuǎn)分化成RPE樣細胞，表明hUC-MSCs有可能會作為供體細胞治療RD。同時，hUC-MSCs的收集具有無創(chuàng)性、無倫理爭議等優(yōu)點，并且已成為臍血庫或干細胞庫常規(guī)收集的一類儲備細胞，與其他干細胞相比，hUC-MSCs離臨床應用可能更近。相信隨著hUC-MSCs分化為成熟的RPE細胞技術(shù)的完善和成熟，將會為細胞移植治療RD提供合適的供體細胞。

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Transdifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into retinal pigment epithelial like cells

WANGLi1,2,3,FANWen-bin1,2,3,LVLi-xia1,2,3,LIPeng1,2,3,TIANHai-bin1,2,3,XUGuo-tong1,2,3

(1.Tongji Eye Institute, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China; 2.Dept.of Regenerative Medicine, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China; 3.Stem Cell Research Center, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the transdifferentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUC-MSCc) into retinal pigment epithelial (RPE) cells.Methods MSC specific markers were identified by flow cytometry in hUC-MSCs, and adipogenesis, osteogenesis and chondrogenesis were confirmed by culturing hUC-MSCsin differentiation media.Sox2, Pax6, Rax, Six6, Nr2e1, Otx2, Lhx2, Crx, Mitf-A, Klf4 and c-Myc were co-infected into hUC-MSCs by lentivirus-mediated system.The hUC-MSCs derived RPE-like cells were characterized by detecting the expressions of specific markers by real-time quantitative-polymerase chain reaction (Q-PCR), immunostaining and Western blot.Results hUC-MSCs were positive for CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 and negative for CD11b, CD34, CD45, HLA-DR.After induction, hUC-MSCs were differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes.Retina and RPE development related transcription factors directly transdifferentiated hUC-MSCs into RPE-like cells which expressed RPE specific markers ZO-1, RPE65, Bestrophin-1, CK8/18, Cralbp, Mertk, Tyrosinase and PEDF.Conclusion hUC-MSCs could be directly transdifferentiated into RPE-like cells by key transcription factors.

human umbilical cord mesenchymal stem cells; retinal pigment epithelial cells; retinal degenerativedisease

10.16118/j.1008-0392.2015.05.001

2015-04-30

國家“九七三”重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2013CB967501)；國家自然科學基金(C120111)

王 麗(1986—)，女，博士研究生.E-mail：1210620@#edu.cn

徐國彤.E-mail：gtxu@#edu.cn

R 774

A

1008-0392(2015)05-0001-07