賈蒙驁，張榮春，商勝華，陳興江，郭玉雙，王仁剛*

1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào) 550081 2.畢節(jié)市煙草公司威寧縣分公司，貴州省畢節(jié)市威寧縣 553100

m型硫氧還蛋白對(duì)馬鈴薯Y病毒侵染煙草的影響

賈蒙驁1，張榮春2，商勝華1，陳興江1，郭玉雙1，王仁剛*1

1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào) 550081 2.畢節(jié)市煙草公司威寧縣分公司，貴州省畢節(jié)市威寧縣 553100

為進(jìn)一步明確病毒與寄主間的相互作用關(guān)系，通過(guò)同源比對(duì)在煙草細(xì)胞中克隆到具有m型硫氧還蛋白（m-type thioredoxin）特征的基因，暫命名為NtTrm。利用原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS）、半定量-PCR以及Northern blot檢測(cè)技術(shù)研究NtTrm的表達(dá)以及NtTrm表達(dá)與PVY積累的關(guān)系。結(jié)果表明，在PVY接種10 d后紅花大金元葉片中NtTrm表達(dá)明顯上調(diào)；在本氏煙草葉片中NtTrm下調(diào)顯著促進(jìn)了PVY在煙草葉片中的積累；而在煙草原生質(zhì)體中NtTrm過(guò)量表達(dá)則會(huì)明顯抑制病毒RNA的積累。初步說(shuō)明煙草細(xì)胞內(nèi)編碼m型硫氧還蛋白的基因受PVY侵染而被誘導(dǎo)表達(dá)，這類(lèi)基因的上調(diào)表達(dá)可能影響PVY在煙草細(xì)胞中的侵染。

煙草；m型硫氧還蛋白；馬鈴薯Y病毒；侵染

在病毒侵染植物過(guò)程中，無(wú)論是病毒基因組的復(fù)制還是病毒在細(xì)胞間的遷移，都依賴(lài)于寄主植物［1］。這個(gè)過(guò)程中病毒的存在會(huì)造成許多寄主的基因表達(dá)量發(fā)生變化，其中以物質(zhì)代謝過(guò)程相關(guān)基因、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因和防衛(wèi)應(yīng)答相關(guān)基因最為常見(jiàn)［2-4］。因此，研究病毒侵染后寄主植物中表達(dá)量發(fā)生變化的基因有助于解釋病毒和寄主特定基因間的作用關(guān)系。Potyvirus是植物病毒中最大的一個(gè)屬，而馬鈴薯Y病毒（PVY）是其中的典型代表。在實(shí)際生產(chǎn)中，PVY引起的病害可嚴(yán)重影響煙草等茄科作物的產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀。已有研究發(fā)現(xiàn)［5］，Potyvirus的侵染可以引起寄主植物中多個(gè)基因表達(dá)量發(fā)生變化，其中以硫氧蛋白家族基因受到的誘導(dǎo)更為明顯。目前硫氧還蛋白有f、m、x和y型，而以f和m型為典型代表［6］。在真核生物中，硫氧蛋白參與了大量的細(xì)胞生命過(guò)程，包括酶活性調(diào)控、活性氧應(yīng)答、基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯等。其中m型硫氧還蛋白（m-Thioredoxin）影響葡萄糖-6磷酸脫氫酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH）的活性［7］，而G6PDH在植物體中參與植物對(duì)生物脅迫的應(yīng)答。在馬鈴薯花葉病毒侵染煙草后，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草細(xì)胞內(nèi)的G6PDH酶活性呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此硫氧蛋白在寄主對(duì)病毒侵染的應(yīng)答中發(fā)揮了一定作用。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)煙草中編碼m型硫氧還蛋白的NtTrm基因的克隆，進(jìn)而揭示NtTrm基因的功能，旨在為進(jìn)一步明確病毒與寄主間的相互作用關(guān)系、篩選抗病靶標(biāo)和制定防治策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物與病毒接種取樣

供試植物為普通煙草（Nicotiana tabacum）品種紅花大金元和本氏煙草（Nicotiana benthamiana），培養(yǎng)條件為24h，16 h光照，8 h黑暗，光暗交替。

供試毒源為PVY貴州分離物，采用金剛砂摩擦接種。紅花大金元品種煙苗在第4片真葉完全展開(kāi)后接種，本氏煙草在第5片真葉完全展開(kāi)后2～3 d接種。采集第一片系統(tǒng)葉（如第4片真葉為接種葉，則第5片真葉即為第一片系統(tǒng)葉，以此類(lèi)推）用于檢測(cè)病毒積累量。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NtTrm的電子克隆

參考林世峰等［8-9］的方法，以玉米硫氧還蛋白基因ZmTrm2的全長(zhǎng)cDNA序列（NCBI序列登錄號(hào)：NM_001157280）為探針，在GenBank中的EST others數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)指定物種煙草（Nicotiana tabacum）進(jìn)行BLAST檢索，并參考公開(kāi)發(fā)表的煙草基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，將檢索到的普通煙草的全部序列表達(dá)標(biāo)簽（EST）進(jìn)行拼接，形成重疊群，再以重疊群為探針進(jìn)行再次檢索，直至無(wú)EST檢出，然后以此片段為參考序列，與中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行比對(duì)，檢索出同源性最高的序列信息。

1.2.2 NtTrm全長(zhǎng)cDNA的獲得

采用RNA純化試劑盒（DP412，中國(guó)Tiangen公司）提取總RNA，以電子克隆獲得的序列為參考設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄引物P2（表1），并根據(jù)cDNA合成試劑盒（A5001，美國(guó)Promega公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行第一鏈cDNA的合成，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物經(jīng)連接后測(cè)序。

1.2.3 NtTrm的半定量RT-PCR檢測(cè)

收集PVY接種后5，10和15 d的普通煙草紅花大金元品種第1片系統(tǒng)葉提取總RNA；根據(jù)NtTrm基因的CDS序列設(shè)計(jì)半定量檢測(cè)引物P5和P6（表1）；以煙草Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物P7和P8（表1）。以1.2.2節(jié)所述方法獲得的cDNA為模板，測(cè)定不同處理NtTrm基因在葉片中的表達(dá)量。1.2.4VIGS載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

表1 引物序列

根據(jù)NtTrm全長(zhǎng)CDS序列，選取其中250 bp左右的區(qū)域，作為RNAi沉默的靶標(biāo)片段。設(shè)計(jì)沉默載體構(gòu)建引物P3和P4時(shí)引入Bam H I和Sal I酶切位點(diǎn)（表1），通過(guò)雙酶切和連接的方法將靶標(biāo)片段構(gòu)建到pgR106植物瞬時(shí)沉默載體中。

pgR106載體的最適合農(nóng)桿菌菌株為GV3101，將構(gòu)建好的載體通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，挑取活性高的菌落搖菌，在吸光值1.0左右收獲菌液，離心（6 000 r/min）10 min后以乙酰丁香酮的緩沖液重懸，靜置2～3 h后浸潤(rùn)本氏煙草完全展開(kāi)的第5片真葉。

在本氏煙草上分別設(shè)置農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種NtTrm-PVX沉默載體、PVX空載體和無(wú)PVX載體接種3組處理，浸潤(rùn)3 d后再接種PVY，接種7 d后檢測(cè)各組處理PVY量的變化。

1.2.5 PVY病毒粒子粗提純與病毒RNA的提取

參照周雪平等［10］的方法進(jìn)行PVY病毒粒子的粗提純。參照Dijkstra等［11］的方法進(jìn)行病毒RNA提取并作改進(jìn)：100 μL病毒中加入160 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）處理的ddH2O，再加入200 μL RNA抽提緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0；200 mmol/L NaCl；5 mmol/L EDTA），然后加入40 μL 10%SDS，混勻，室溫保持5 min；之后用酚仿抽提，最后用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥；所得RNA溶于30 μL DEPC處理的dH2O中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 NtTrm瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建和煙草原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化

利用P1和P2引物中引入的Sal I和Sac I雙酶切位點(diǎn)（表1），采用雙酶切和連接的方法，將NtTrm CDS全長(zhǎng)克隆到pGFP植物瞬時(shí)表達(dá)載體中［5］。煙草原生質(zhì)體的制備、質(zhì)粒DNA和病毒RNA的共轉(zhuǎn)染參考哈佛大學(xué)Jen Sheen實(shí)驗(yàn)室總結(jié)的操作方法（http：//molbio.mgh.harvard.edu/ sheenweb/jen_archive.html），以PEG介導(dǎo)，按10 μg質(zhì)粒DNA和10 μg PVY病毒粒子RNA轉(zhuǎn)染2×105個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞的比例完成轉(zhuǎn)染，空白對(duì)照只轉(zhuǎn)染10 μg PVY病毒粒子RNA。轉(zhuǎn)染完成后，原生質(zhì)體在25℃條件下，黑暗放置12 h，之后進(jìn)行RNA分析。

1.2.7 地高辛探針標(biāo)記和Northern blot檢測(cè)

配制10×dNTP×DIG（1 μL 10 mmol/L dATP，1 μL 10 mmol/L dGTP，1 μL 10 mmol/L dCTP，0.65 μL 10 mmol/L dTTP，3.5 μL DIG-11-dUTP，補(bǔ)水至10 μL）；以PVY檢測(cè)引物（P9/P10）擴(kuò)增到的部分病毒序列為模板，采用PCR標(biāo)記的方法標(biāo)記地高辛探針。反應(yīng)體系與常規(guī)25 μL PCR反應(yīng)相同。標(biāo)記模板需經(jīng)切膠回收純化，然后以1∶1 000稀釋。

用于Northern雜交的總RNA經(jīng)過(guò)甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳后，采用虹吸法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后采用紫外交聯(lián)加高溫處理方法固定。雜交使用Thermo分子雜交爐，采用地高辛探針雜交，地高辛檢測(cè)抗體使用Roche的Anti-Digoxigenin-AP和Fab fragments，最后加入CSPD，通過(guò)暗室X-光片曝光顯示結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtTrm基因CDS序列的獲得

以電子克隆獲得的序列信息為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物（表1），以紅花大金元總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，可以擴(kuò)增到與預(yù)期分子量相近的特異條帶。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，這段DNA共有549 bp（圖1），按照其序列推測(cè)的蛋白為182個(gè)氨基酸，功能結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)其C端具有硫氧還蛋白超家族保守結(jié)構(gòu)域（圖2）。將該氨基酸序列與已報(bào)道的玉米ZmTrm2氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對(duì)，功能結(jié)構(gòu)域完全吻合。

圖1 NtTrm CDS序列

圖2 由NtTrm CDS推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 PVY侵染誘導(dǎo)NtTrm的表達(dá)

通過(guò)半定量RT-PCR方法對(duì)PVY侵染的煙苗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，與未接種PVY的煙苗相比，紅花大金元在病毒接種5 d后，NtTrm表達(dá)量較少，但在10 d時(shí)表達(dá)量明顯上調(diào)，而15 d又有明顯下調(diào)。由于PVY侵染普通煙一般7～10 d開(kāi)始顯現(xiàn)莖脈壞死癥狀，因此推測(cè)NtTrm在PVY侵染開(kāi)始顯現(xiàn)典型癥狀時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)。

圖3 PVY侵染對(duì)NtTrm表達(dá)的影響

2.3 沉默NtTrm對(duì)PVY積累的影響

利用Northern blot方法對(duì)各處理組的第1片系統(tǒng)葉中PVY的積累量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖4B）顯示，與無(wú)PVX載體預(yù)接種相比，PVX空載體接種的煙株第1片系統(tǒng)葉中PVY的積累量略有增加，NtTrm-PVX沉默載體預(yù)接種的煙株第1片系統(tǒng)葉中PVY的積累量升高非常明顯。這說(shuō)明NtTrm的下調(diào)表達(dá)有利于PVY在煙草細(xì)胞中積累。

圖4 沉默NtTrm對(duì)PVY在本氏煙草中積累的影響

2.4 瞬時(shí)表達(dá)NtTrm抑制PVY RNA的積累

將pGFP-NtTrm載體和PVY病毒RNA共轉(zhuǎn)染到煙草原生質(zhì)體內(nèi)。轉(zhuǎn)染12 h后，通過(guò)Northern Blot的方法檢測(cè)PVY RNA的積累量。PVY RNA的積累檢測(cè)結(jié)果（圖5）表明，只轉(zhuǎn)染PVY RNA的原生質(zhì)體和共轉(zhuǎn)染pGFP空載體/PVY RNA的原生質(zhì)體中，PVY RNA積累量沒(méi)有差異；在共轉(zhuǎn)染pGFP NtTrm載體/PVY RNA的原生質(zhì)體中，PVY RNA積累量明顯下調(diào)。說(shuō)明NtTrm超量表達(dá)對(duì)于PVY RNA的積累有抑制作用，而且抑制作用可能作用于復(fù)制相關(guān)途徑中。

圖5 瞬時(shí)表達(dá)NtTrm對(duì)PVY RNA積累量的影響

3 結(jié)論與討論

通過(guò)同源克隆方法在煙草中克隆到了編碼m型硫氧還蛋白的基因NtTrm。該基因的表達(dá)受到PVY的侵染誘導(dǎo)，沉默和過(guò)表達(dá)試驗(yàn)表明下調(diào)NtTrm會(huì)促進(jìn)病毒積累，反之則抑制病毒RNA的積累。說(shuō)明煙草中編碼m型硫氧還蛋白的基因與PVY侵染關(guān)系密切。

值得注意的是，在PVY侵染后NtTrm基因表達(dá)變化方向并不是單一的，這說(shuō)明調(diào)控其表達(dá)的未知寄主因子在病毒侵染的不同時(shí)期發(fā)揮著不同作用，值得進(jìn)一步深入研究。另外，病毒RNA積累受抑制有可能源自胞間移動(dòng)的影響，也有可能是受復(fù)制影響，而在原生質(zhì)體中上調(diào)表達(dá)NtTrm抑制病毒RNA的積累則說(shuō)明這種抑制可能是發(fā)生在病毒復(fù)制過(guò)程中。但這種抑制的作用機(jī)理仍不清楚，尚需要進(jìn)一步試驗(yàn)。

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責(zé)任編輯 董志堅(jiān)

Effects of m-Type Thioredoxin onPotato Virus Y（PVY）Infected Tobacco

JIA Mengao1,ZHANG Rongchun2,SHANG Shenghua1,CHEN Xingjiang1,GUO Yushuang1, and WANG Rengang*1
1.Guizhou Academy of Tobacco Science,Key Laboratory of Molecular Genetics of China Tobacco,Guiyang 550081, China
2.Weining Branch of Bijie Tobacco Company,Weinig 553100,Guizhou,China

In order to further confirm the interactive relationships between virus and its host,a gene featured the characters of m-type thioredoxin in tobacco cell was cloned by homologous alignment and named as NtTrm.The expression of NtTrm and its relationship with PVY accumulation were studied by protoplast transient transformation,virus-induced gene silencing（VIGS）,semi-quantitative RT-PCR and Northern blot test technologies.The results showed that the expression of NtTrm in leaves of cv. Honghuadajinyuan was obviously up-regulated 10 days after PVY inoculation;the down-regulation of NtTrm significantly promoted the accumulation of PVY in leaves of Nicotiana benthamiana;while the overexpression of NtTrm in tobacco protoplast obviously inhibited the accumulation of PVY viral RNA.It preliminarily indicated that NTtrm could be induced by PVY infection and its up-regulated expression might affect the PVY infection in tobacco cells.

Tobacco；m-Type thioredoxin；Potato virus Y（PVY）；Infection

S43

A

1002-0861（2015）11-0011-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151103

2015-01-19

2015-05-06

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目“貴州煙草馬鈴薯Y病毒分子變異和重組研究”（黔科合J字［2013］2194）；中國(guó)煙草總公司貴州省公司資助項(xiàng)目“貴州煙草有害生物調(diào)查研究”（2010-22）和“煙草抗性快速鑒定體系在抗病育種中的應(yīng)用研究”（2009-11）。

賈蒙驁（1983─），博士，副研究員，主要從事煙草病毒學(xué)研究。E-mail：jiamengao@126.com；*

王仁剛，E-mail：rengangwang@126.com

賈蒙驁，張榮春，商勝華，等.m型硫氧還蛋白對(duì)馬鈴薯Y病毒侵染煙草的影響［J］.煙草科技，2015，48（11）：11-15. JIA Mengao,ZHANG Rongchun,SHANG Shenghua,et al.Effects of m-type thioredoxin on Potato virus Y(PVY) infected tobacco［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：11-15.