熊瑞華,孫繼民,呂海濤

(1.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心 兒內(nèi)科，湖北 武漢 430015；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

?

川崎病患兒體內(nèi)趨化因子SDF-1α/CXCR4和MCP-1的表達(dá)研究

熊瑞華1,孫繼民1,呂海濤2

(1.武漢市婦女兒童醫(yī)療保健中心 兒內(nèi)科，湖北 武漢 430015；2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，江蘇 蘇州 215000)

目的 探討川崎病患兒體內(nèi)趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-l/CXC型趨化因子受體(SDF-1α/CXCR4)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)在川崎病(Kawasaki disease,KD)發(fā)生過程中及冠狀動(dòng)脈損傷中的作用及意義。方法 選取66例KD患者為實(shí)驗(yàn)組，其中冠狀動(dòng)脈損害(coronary artery lesions,CAL)17例和無冠狀動(dòng)脈損害(NCA)49例，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)和酶聯(lián)反應(yīng)吸附(ELISA)方法，分別測(cè)定KD 2個(gè)時(shí)期(緩解期與急性期)時(shí)血漿中SDF-1α和MCP-1的濃度及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CXCR4 mRNA和MCP-1 mRNA的表達(dá)變化。以65例非感染患兒作為對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果 KD組急性期患者血漿SDF-1α水平和PBMC中CXCR4 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，而緩解期與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CAL患者與NCA患者血漿中SDF-1α水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 KD組急性期患者血漿MCP-1水平與PBMC中MCP-1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；CAL患者和NCA患者血漿中MCP-1水平與PBMC中MCP-1 mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SDF-1α/CXCR4可能參與了KD發(fā)病過程，但可能與冠狀動(dòng)脈損害無關(guān)。川崎病患兒體內(nèi)MCP-l呈持續(xù)增高狀態(tài)，尤其是CAL患者，因此該趨化因子可用于判斷KD的病情及冠狀動(dòng)脈損害程度。

川崎??； SDF-1α/CXCR4；MCP-1；趨化因子

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征，主要的病理反應(yīng)是全身血管炎變，是一種以急性、發(fā)熱性和出疹性為特征的小兒疾病[1]，以6～18月嬰兒最多見。最嚴(yán)重的并發(fā)癥是冠狀動(dòng)脈損害及心臟疾病[2]，主要發(fā)生在急性期[3]，可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化。但其作用機(jī)制尚未明確，研究表明有多種因素參與其中[4]。其中，研究表明誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)是KD發(fā)病過程中的重要參與者，同時(shí)也參與冠狀動(dòng)脈損害。Yu等[5]發(fā)現(xiàn)在KD不同階段不同細(xì)胞表達(dá)iNOS的水平顯著增加，可能與中性粒細(xì)胞受到急性炎性刺激有關(guān)，并觸發(fā)冠狀動(dòng)脈組織損傷。iNOS相關(guān)的趨化因子在KD發(fā)病機(jī)制中也扮演重要的角色。因此，本研究旨在通過觀察KD患兒體內(nèi)趨化因子SDF-1α/CXCR4和MCP-1的表達(dá)變化，探討KD及其冠狀動(dòng)脈損害并發(fā)癥的作用機(jī)理，為臨床預(yù)防、診斷和治療川崎病提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 主要試劑及來源：瓊脂糖(北京索萊寶有限公司)、氯仿、乙醇、異丙醇(天津市康科德有限公司)；RNAsin RNA酶抑制劑(華美生物工程公司)；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；一氧化氮試劑盒(北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司)；TRIZOL試劑(細(xì)胞總RNA提取用，美國(guó)Invitrogen公司)；Tap DNA聚合酶(北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；熱啟動(dòng)熒光PCR核心試劑盒(上海睿誠(chéng)生物科技有限公司)。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：PHB-01型恒溫水浴箱(天津艾維歐科技發(fā)展有限公司)；QL-901型旋渦混和器(上海天呈科技有限公司)；V-160紫外分光光度儀(日本島津公司)；GT10-1型高速離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；凝膠圖像掃描系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)；MxI3000P型熒光定量PCR儀(美國(guó)Agilent Stratagene)；9700型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均為2013年3月～2014年3月某醫(yī)院兒科就診的患兒。66例KD組患兒均符合KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中男37例，女29例，平均年齡(1.95±0.32)歲，其中17例冠狀動(dòng)脈損害者。非感染組(對(duì)照組)為65例，男48例，女17例，平均年齡(2.15±0.54)歲；對(duì)照組患兒的年齡、性別與KD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)反應(yīng)吸附(ELISA)法測(cè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(急性期與緩解期)患兒血漿中SDF-1α和MCP-1的濃度，在450 nm處測(cè)定吸光度值，求其濃度。同時(shí)采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)[7]測(cè)定外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CXCR4 mRNA和MCP-1 mRNA的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 2組 SDF-1α/ CXCR4表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，KD組急性期和緩解期血漿中SDF-1α濃度均明顯增加(P<0.05)；KD組中CAL緩解期和急性期血漿中SDF-1α濃度與NCA相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，KD組急性期和緩解期PBMC 中CXCR4 mRNA表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05，P<0.01)；KD組急性期CAL比NCA CXCR4 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；緩解期時(shí)2者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、表2。

表1 KD組與對(duì)照組SDF-1α濃度和CXCR4 mRNA表達(dá)比較

*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組比較，compared with control group

表2 KD組不同時(shí)期SDF-1α和CXCR4 mRNA表達(dá)比較

#P<0.05，與CAL相比，compared with CAL group

2.2 2組MCP-l表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，KD組緩解期和急性期患者血漿中MCP-l水平與PBMC中MCP-1mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；在急性期與緩解期，KD組NCA血漿MCP-1水平與PBMC中MCP-1mRNA表達(dá)水平均明顯低于CAL(P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見表3、表4。

表3 KD組與對(duì)照組MCP-l濃度和MCP-1mRNA表達(dá)比較

*P<0.01，與對(duì)照組相比，compared with control group

表4 KD組不同時(shí)期MCP-l濃度和MCP-l mRNA表達(dá)比較

#P<0.05，##P<0.01，與CAL相比，compared with CAL group

3 討論

近年來，川崎病的發(fā)病率不斷升高[8]，越來越受到人們的重視，尤其是導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈損害[9]，嚴(yán)重威脅嬰幼兒的健康和生命。雖然有過大量的臨床研究和探索，但川崎病的作用機(jī)制還是不明確。以往研究表明KD可能的發(fā)病機(jī)制有超抗原反應(yīng)、系統(tǒng)性免疫激活、金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)的代謝紊亂、中性粒細(xì)胞功能紊亂以及血管內(nèi)皮功能紊亂[10]。一氧化氮(NO)是20世紀(jì) 80年代后期發(fā)現(xiàn)的一種新型生物信息分子，在調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的許多生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)NO也可舒張血管。許多研究表明川崎病急性期NO 的表達(dá)明顯高于非感染對(duì)照組，并且也可能是導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈損害的關(guān)鍵性因素[11-14]。研究表明NO可能參與了SDF-1α和其受體CXCR4作用誘導(dǎo)的趨化過程，并且單核細(xì)胞在KD的發(fā)病機(jī)制中也可能發(fā)揮重要作用[15]。有必要進(jìn)一步從蛋白水平和翻譯水平檢測(cè)KD患兒體內(nèi)SDF-1α和MCP-1濃度的變化及其受體CXCR4 mRNA和MCP-1 mRNA的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化。因此，本驗(yàn)對(duì)川崎病患兒血漿中SDF-1α和MCP-1濃度及外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CXCR4 mRNA和MCP-1 mRNA的表達(dá)水平變化進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)川崎病患兒體內(nèi)SDF-1α血漿濃度和CXCR4 mRNA表達(dá)水平發(fā)生了改變，僅在急性期呈持續(xù)增加狀態(tài)，緩解期則相對(duì)減少。但是對(duì)于冠狀動(dòng)脈損害組(CAL)和無冠狀動(dòng)脈損害組(NCA)，2者的濃度和表達(dá)水平幾乎差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，也表明SDF-1α水平的改變，可能不會(huì)引起冠狀動(dòng)脈損害的并發(fā)癥，僅在KD急性期中起著重要作用，對(duì)于川崎病機(jī)制的研究，它可能不是關(guān)鍵的趨化因子。研究顯示川崎病患兒體內(nèi)趨化因子MCP-1血漿濃度及mRNA表達(dá)水平均呈持續(xù)增加狀態(tài)，與香港學(xué)者Cheung YF等[16]發(fā)現(xiàn)KD伴有冠狀動(dòng)脈損害的患兒體內(nèi)MCP-1濃度顯著增加，表明MCP-l與 KD及其冠狀動(dòng)脈損害有一定的相關(guān)性，可用于KD病情的判斷及作為冠狀動(dòng)脈損害的免疫學(xué)指標(biāo)結(jié)果一致，與李小青等[17]采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)MCP-1基因-2518 G/A多態(tài)性，并用ELISA法檢測(cè)KD患兒及健康兒童血清MCP-1濃度，結(jié)果表明基因多態(tài)性在一定程度上可能對(duì)KD伴發(fā)冠狀動(dòng)脈損害產(chǎn)生重要影響一致。

目前，減輕冠狀動(dòng)脈損害最有效的辦法是靜脈丙種蛋白(IVIG)，可能與NO含量下降有關(guān)。因此，可進(jìn)一步研究其在KD過程中的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)的研究屬于初步探索，僅說明了在KD患兒血漿及PBMC中趨化因子SDF-1α/CXCR4和MCP-1的動(dòng)態(tài)變化，未能真正地解釋KD的發(fā)病機(jī)制。并且對(duì)于SDF-1α及其受體在冠狀動(dòng)脈損害過程中是否發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。因此本實(shí)驗(yàn)下一步將研究趨化因子的某些受體的作用機(jī)理，為預(yù)防和治療川崎病提供一定依據(jù)。

[1] 陳瑋.川崎病的發(fā)病機(jī)制及早期臨床診斷研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2010，17(2)：410-412.

[2] 劉權(quán)娥，梅帥虎.大劑量靜脈注射丙種球蛋白防治小兒川崎病冠狀動(dòng)脈病變臨床療效分析[J].醫(yī)學(xué)信息，2010，9 (15)：236.

[3] Pinna GS,Kafetzis DA,Tselkas OI,et al.Kawasaki disease:an over view[J].Curr Opin Infect Dis,2008,21(3):263-270.

[4] Kowalczyk M,Turska-Kmie A,Ziokowska L,et al.Symptoms,diagnosis and characteristic abnormalities in the coronary arteries in Kawasaki disease in children[J].Med Wieku Rozwoj,2010,14(4):344-349.

[5] Yu X,Hirono KI,Ichida F,et al.Enhanced iNOS expression in leukocytes and circulating endothelial cells is associated with the progression of coronary artery lesions in acute Kawasaki disease[J].Pediatr es,2004,55(4): 688-694.

[6] Newburger JW,Takahashi M,Gerber MA,et al.Diagnosis,treatment,and long -term management of Kawasaki disease:a statement for health professionals from the Committee on Rheumatic Fever,Endocarditis and Kawasaki Disease,Council on Cardiovascular Disease in the Young,American Heart Association[J].Circulation,2004,110(17):2747-2771.

[7] 常賀，李剛，王焱，等.免疫球蛋白 IgG 對(duì) H2O2所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的抑制作用及其機(jī)制[J]，中國(guó)生化藥物雜志，2012，33(6)：713-715.

[8] 張永蘭，杜忠東，趙地.2000-2004年北京川崎病住院患兒流行病學(xué)調(diào)查[J].實(shí)用兒科臨床雜志，2007，22(1)：12-15.

[9] Yeom JS,Woo HO,Park JS,et al.Kawasaki disease in infants[J].Korean J Pediatr,2013,56(9):377-382.

[10] 黃瀅，吳柱國(guó).川崎病發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)狀[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，28(1)：57-60.

[11] 胡靜，沙紅，李琪.川崎病冠脈損傷與血漿一氧化氮的相關(guān)性及其高危因素預(yù)測(cè)[J].臨床兒科雜志，2010，28(7)： 633-636.

[12] Li XH,Zhang CY,Wu JX,et al.Changes in plasma hydrogen sulfide and nitric oxide levels and their clinical significance in children with Kawasaki disease[J].Chin Med J,2011,124 (21):3445-3449.

[13] 劉麗莎，戈建軍，高嶺，等.MMP-9 和 NO 在川崎病患兒急性期血清中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J]，2010，18(24)：4288-4290.

[14] Sato S,Tsukahara H,Ohta N,et al.Endothelial dysfunction in Kawasaki disease: focus on nitric oxide[J].Pediatr Int,2004,46(1):114.

[15] 田秀麗.急性期川崎病單核細(xì)胞活化型和抑制型FcγR表達(dá)初探[C].重慶醫(yī)科大學(xué).2013，5.

[16] Cheung YF,OK,Tam SC,et al.Induction of MCP1,CCR2,and iNOS expression in THP-1 macrophages by serum of children late after Kawasaki disease[J].Pediatr Res,2005,58(6):1306-1310.

[17] 李小青，周南，曹三成，等.單核細(xì)胞趨化因子-1基因多態(tài)性與川崎病的相關(guān)性研究[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2009，24(10)：772-774.

(編校：吳茜)

Study on chemokine SDF-1α/CXCR4 and MCP-1 expression in Kawasaki disease

XIONG Rui-hua1,SUN Ji-min1,LV Hai-tao2

(1.Department of Pediatrics, Wuhan Municipal Women and Children Health Care Center, Wuhan 430015, China;2.Children’s Hospital Affiliated to Suzhou University, Suzhou 215000, China)

ObjectiveTo explore the effect and significance of SDF-1α / CXCR4 and MCP-1 in the course of Kawasaki disease (KD) and the occurrence of coronary artery lesions.Methods66 cases of KD patients were as experimental group, in which 17 cases had coronary artery lesions (CAL) and the others had NCA.The concentration of SDF-1α and MCP-1 were measured with ELISA, and the expressions of CXCR4 mRNA and MCP-1 mRNA were examined with qRT-PCR, respectively.ResultsThe plasma SDF-1α levels and CXCR4 mRNA expression of PBMC in acute phase of KD group were significantly higher than that in control group (P<0.01); plasma levels of SDF-1α in CAL had no significant difference with NCA.MCP-1 levels and MCP-1 mRNA expression of PBMC in acute phase of KD group were significantly higher than that in control group (P<0.01), and the differences of these indexes between CAL and NCA were significant (P<0.05). ConclusionSDF-1α / CXCR4 may be involved in the pathogenesis of KD, but may not be related to coronary artery lesions; the concentration of MCP-l was increased markedly, and it can be used to determine the extent of damage of KD.

Kawasaki disease; stromal cell-derived factor -1/CXC chemokine receptor; monocyte chemoattractant protein-1; chemokines

2011年江蘇省醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目基金(H201127)

熊瑞華，男，本科，主治醫(yī)師，研究方向：兒童危重癥疾病，E-mail：xrh13308630733@163.com。

R453.9

A

1005-1678(2015)01-0119-03