肖麗,李坤

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031)

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青藤堿對(duì)小鼠復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)妊娠結(jié)局的影響及其相關(guān)機(jī)制研究

肖麗1,李坤2

(1.山東省交通醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 濟(jì)南 250031)

目的 研究青藤堿對(duì)復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)模型小鼠妊娠結(jié)局的影響及相關(guān)機(jī)制。方法 雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠20只、Balb/c小鼠10只，按雌雄比例2:1合籠，檢出陰栓者計(jì)為妊娠第1天。分為正常組：雌性CBA/J小鼠×雄性Balb/c小鼠，正常飲食，9只孕鼠；模型組：雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠，正常飲食，10只孕鼠；治療組：雌性CBA/J小鼠×雄性DBA/2小鼠，自檢出陰栓日開始改用含有0.5%青藤堿的飼料，10只孕鼠。計(jì)數(shù)存活胚胎數(shù)和丟失胚胎數(shù)，并計(jì)算胚胎丟失率。使用ELISA法檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IFN-γ和IL- 4的水平；real-time PCR檢測(cè)IL-4、INF-γ、GATA-3、T-bet基因的表達(dá)水平；Western blot測(cè)IL-4、INF-γ、GATA-3、T-bet蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 胚胎丟失率結(jié)果表明：與模型組比較，正常組和治療組的胚胎丟失率顯著降低(P<0.01)。ELISA結(jié)果顯示：與正常組相比較，模型組和治療組中血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4的水平均顯著升高(P<0.01)，IL-4水平均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，治療組中血清中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4 比值均顯著降低(P<0.01)，而IL-4水平變化不大。Real-time PCR和Western blot的結(jié)果均顯示：與正常組相比較，模型組和治療組中IL-4、GATA-3 基因的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)；IFN-γ、T-bet 基因的表達(dá)水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3比值均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，治療組中IFN-γ、T-bet 基因的表達(dá)水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值顯著降低(P<0.01)。結(jié)論 青藤堿可以減少復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生，其中RSA與Th1/Th2 平衡漂移至Th1 型有關(guān)；青藤堿治療復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的可能機(jī)制為降低體內(nèi)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及轉(zhuǎn)錄因子T-bet 的水平，從而調(diào)節(jié)Th1/ Th2 平衡。

青藤堿；復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；INF-γ；IL-4；T-bet；GATA-3

目前免疫型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)的主要表現(xiàn)為正常妊娠免疫反應(yīng)失衡， 涉及到特異性人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)表達(dá)增加， 1型輔助性T細(xì)胞(helper T cell-1，Th1)/2型輔助性T細(xì)胞(helper T cell-2，Th2)的細(xì)胞因子平衡失調(diào)等致流產(chǎn)。治療主要采用免疫治療方案[1-2]， Th1 以分泌 白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)等為主，這些細(xì)胞因子起免疫殺傷作用，直接或間接損害早期胎盤細(xì)胞分化和生長(zhǎng)，對(duì)胚胎發(fā)育有毒性作用，可以導(dǎo)致流產(chǎn)；Th2 以分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 及IL-13 等為主，這些因子主要介導(dǎo) B細(xì)胞增殖抗體生成，輔助體液免疫，產(chǎn)生和介導(dǎo)同種排斥反應(yīng)的免疫耐受。國內(nèi)外的研究證明，Th1 與 Th2 細(xì)胞因子平衡與妊娠結(jié)局關(guān)系密切[4]。對(duì)于自身免疫型RSA 的治療主要為抑制免疫性炎癥和阻止血栓形成，常用的藥物有腎上腺皮質(zhì)激素如潑尼松，抗凝藥物如低分子肝素和小劑量阿司匹林[5-7]。同種免疫型RSA 主要采取主動(dòng)免疫治療，在臨床上可以采用患者丈夫的淋巴細(xì)胞進(jìn)行脫敏，促進(jìn)母體產(chǎn)生保護(hù)性封閉因子，從而抑制母胎免疫排斥反應(yīng)以保護(hù)妊娠[8-9]。

祖國醫(yī)學(xué)對(duì)RSA 認(rèn)識(shí)已久，對(duì)其辨證分型以及治療也有較為系統(tǒng)的研究，許多中藥制劑如助孕Ⅰ號(hào)、Ⅱ號(hào)，養(yǎng)血安胎顆粒，柴苓湯等都被用來治療RSA，并取得了一定的療效[10-12]。青藤堿(sinomenine，SIN)是從中藥青風(fēng)藤中提取出來的一種單體生物堿，目前藥用的多為青風(fēng)藤的鹽酸鹽。青藤堿有明顯的抗炎作用，可以在不同程度上抑制體液免疫和細(xì)胞免疫。有研究表明，青藤堿對(duì)人外周血和小鼠脾淋巴細(xì)胞有抑制作用[13]，對(duì)T 細(xì)胞的活化和Th1 型細(xì)胞因子的釋放也有抑制作用[14]。盡管青藤堿藥理作用很廣泛，但是目前青藤堿的臨床應(yīng)用主要在治療風(fēng)濕病、心律失常和強(qiáng)直性脊柱炎，近年來，也用于治療慢性腎炎、腎小球疾病和腫瘤等，但青藤堿用于治療復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)則少見報(bào)道。本研究首先建立RSA的小鼠模型，再通過比較正常妊娠、自然流產(chǎn)模型和青藤堿治療各組孕鼠胚胎丟失率的變化，并檢測(cè)各組孕鼠Th1和Th2型細(xì)胞因子、相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化和Th1和Th2型細(xì)胞平衡情況(IFN-γ/IL-4、T-bet/GATA-3 比值反映) ，旨在探討青藤堿對(duì)RSA是否有治療作用及可能的治療機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性CBA/J(60只)、雄性DBA/2(20只)購自北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0015)；Balb/c雄性小鼠(10只)購自湖北省疾病預(yù)防控制中心(許可證號(hào)：SYXK(鄂)2008-0014)，所有動(dòng)物均是SPF級(jí)，8周齡，平均體質(zhì)量(85±3.55)g。

1.2 藥品與試劑 含有0.5%青藤堿的飼料(青藤堿購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，0.5%青藤堿飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司加工合成)；RT-PCR試劑盒(Fermentas 公司)；SYBR Premix Ex TapTM(Takara，寶生物工程有限公司)；IL-4、IFN-γ、GATA3 和T-bet 上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；十二烷基磺酸鈉(SDS)(美國Sigma 公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)(杭州碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒(武漢谷歌生物科技有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組 所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物房，自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境相同。適應(yīng)性喂養(yǎng)2天后，將雌性CBA/J隨機(jī)分為3組，每組20只，分別與雄性DBA/2和Balb/c小鼠按雌雄比例2:1合籠交配，合籠后第2天早上8點(diǎn)檢測(cè)雌鼠陰栓，檢出陰栓者計(jì)為妊娠第1天，分別建立模型。

從每組20只中隨機(jī)選取10只模型建立成功的小鼠分為：正常妊娠組(以下簡(jiǎn)稱正常組)(CBA/J、BALB/c)：9只，正常飲食；自然流產(chǎn)模型組(以下簡(jiǎn)稱模型組)(CBA/J、DBA/2)：10只，正常飲食；青藤堿治療組(以下簡(jiǎn)稱治療組)(CBA/J、DBA/2)：10只，自檢出陰栓日開始改用含有0.5%青藤堿的飼料。本文所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)條例》。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 各組胚胎丟失率：妊娠第13天內(nèi)眥靜脈取血后，頸椎脫臼法處死各組CBA/J 小鼠，打開腹腔，暴露子宮，用眼科剪刀分離出子宮，用生理鹽水洗凈后置于干凈濾紙上，計(jì)數(shù)存活胚數(shù)和丟失胚胎數(shù)，并計(jì)算胚胎丟失率(R)。

胚胎丟失的判斷：丟失胚胎的體積明顯縮小，胎兒-胎盤單位有明顯的出血或壞死，胚胎組織變性或壞死；

胚胎丟失率的計(jì)算：胚胎丟失率(R)=丟失胚胎數(shù)/(丟失胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù))×100%，觀察時(shí)間為妊娠第13天。

1.4.2 血清中IFN-γ和IL- 4的水平：血清細(xì)胞因子水平的測(cè)定按照ELISA 試劑盒操作程序進(jìn)行；測(cè)定：以空白孔調(diào)零，在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量各孔的吸光度值(OD 值)；測(cè)定需要在加入終止液后15 min 內(nèi)進(jìn)行。

1.4.3 蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及T-bet 基因的表達(dá)水平：取0.2 mL無RNA酶的EP管，加入RNA模板5 μL，Oligo(dT)15(10 μM)2 μL，dNTP(2.5 mM) 2 μL，用DEPC處理水調(diào)整體積至14.5 μL，70 ℃處理5 min，短暫離心后置于冰上，再依次加入5×緩沖液4 μL；RNA酶抑制劑 0.5 μL；M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL；DEPC水調(diào)整總體積至20 μL震蕩混勻后離心，設(shè)置反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。得到的cDNA 產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及 T-bet的序列。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，其中2×SYBR Premix ExTapTM10 μL, 2.5 μmol/L 引物 2 μL(上下游各1 μL), 50×ROX Reference DyeⅡ0.4 μL, cDNA temples 1 μL, dH2O 6.6 μL。設(shè)置反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s 預(yù)變性,95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，60 ℃ 60 s，共40 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 34 s收集熒光信號(hào)。每1個(gè)樣本做 3 個(gè)平行管?；虮磉_(dá)的相對(duì)變化采用△△Ct 法處理。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)△Ct 表示基因的相對(duì)定量，Ct 值表示目的基因產(chǎn)物達(dá)到閾值所需要的循環(huán)數(shù)?！鰿t=△Ct(樣品)-△Ct(內(nèi)參)，△△Ct=△Ct(樣品)-△Ct(標(biāo)準(zhǔn))。

1.4.4 蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4 、GATA-3及T-bet蛋白的表達(dá)水平：蛋白濃度測(cè)定按照BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行；570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各管蛋白吸光度；繪制蛋白濃度曲線，計(jì)算各樣品蛋白濃度；用PBS將蛋白樣品濃度稀釋至5 μg/μL，EP 管分裝，-70 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 胚胎丟失率 本實(shí)驗(yàn)中共30 只雌鼠，中途意外死亡1 只。各組胚胎丟失情況見表1。與模型組比較，正常組和治療組的胚胎丟失率顯著降低(P<0.01)。

表1 各組孕鼠胚胎丟失率

*P<0.01，與模型組相比較，compared with model group

2.2 ELISA檢測(cè)血清中IFN-γ、IL- 4 水平 以各組孕鼠子宮蛻膜組織中IFN-γ、IL-4及IFN-γ/IL-4蛋白的表達(dá)水平見表2。與正常組相比較，模型組和治療組中血清IFN-γ和IFN-γ/IL-4的水平均顯著升高(P<0.01)，IL-4 水平均顯著降低(P<0.01)；與模型組相比較，治療組中血清中IFN-γ水平和IFN-γ/IL-4 比值均顯著降低(P<0.01)，而治療組的IL-4水平變化不大。

表2 各組血清IFN-γ、IL- 4 和IFN-γ/IL-4水平

#P<0.01，與正常組相比，compared with normal group；*P<0.01，與模型組相比，compared with model group

2.3 各組蛻膜中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 基因的相對(duì)表達(dá)量 由IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 和GAPDH 基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線(見圖1)，所有基因的擴(kuò)增效率均恒定，已達(dá)到平臺(tái)期，Ct 值即閾值循環(huán)數(shù)穩(wěn)定；熔解曲線均呈單峰，表示引物的特異性好，無引物二聚體產(chǎn)生。故可以使用該體系對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析。

圖1 IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 和GAPDH 基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線Fig.1 Amplification curve and melting curve of IFN-γ, IL-4, GATA-3, T-bet and GAPDH gene

按照公式相對(duì)表達(dá)量RQ(relative quantity)=2-△△Ct分別計(jì)算各組孕鼠子宮蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 基因的相對(duì)表達(dá)量，見表3。與正常組相比較，模型組和治療組中IL-4、GATA-3基因的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IFN-γ、T-bet 基因的表達(dá)水平以及IFN-γ/IL-4比值、T-bet/GATA-3 比值均顯著升高(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組相比，治療組中IFN-γ、T-bet 基因的表達(dá)水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值顯著降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 各組IFN-γ、IL- 4、GATA-3和T-bet 基因的相對(duì)表達(dá)量

#P<0.01與正常組相比，compared with normal group；*P<0.01，與模型組相比，compared with model group

2.4 Western blot檢測(cè)蛻膜中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 的水平 以各組孕鼠子宮蛻膜組織中IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet蛋白的表達(dá)水平與GAPDH 蛋白的表達(dá)水平的比值作為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量，見表4。與正常組相比，模型組和治療組中IL-4、GATA-3蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，IFN-γ、T-bet 蛋白的表達(dá)水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，治療組中IFN-γ、T-bet蛋白的表達(dá)水平以及IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 比值顯著降低(P<0.01)。蛋白條帶圖可以看出IFN-γ、T-bet 、GATA-3、IL-4的表達(dá)情況，見圖2。

表4 各組IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 蛋白的相對(duì)表達(dá)量

#P<0.01，與正常組相比，compared with normal group；*P<0.01，與模型組相比，compared with model group

圖2 各組IFN-γ、IL- 4、GATA-3、T-bet 蛋白表達(dá)1-3 正常組;4-6 模型組;7-9 治療組Fig.2 The protein expression levels of IFN-γ,IL- 4,GATA-3,T-bet 1-3 normal group; 4-6 model group;7-9 treatment group

3 討論

RSA發(fā)生與Th1/Th2平衡有關(guān)，以Th1來源的 IL-2，IFN-γ等不利于妊娠，導(dǎo)致流產(chǎn)。而以Th2來源的IL-4等有利于妊娠。研究證實(shí)，IFN-γ產(chǎn)生減少與Thl型反應(yīng)減弱有關(guān)，T-bet 的表達(dá)與 IFN-γ的誘導(dǎo)產(chǎn)生一致[15]。研究顯示，T-bet 選擇性表達(dá)于 Th1 細(xì)胞而非 Th2 細(xì)胞[16]，T-bet 小鼠顯示 Th1 極化的缺陷。T-bet還可下調(diào) GATA-3 基因表達(dá)。T-bet 和 GATA-3通過染色質(zhì)的改型分別激活 Th1 細(xì)胞因子 IFN-γ 和Th2 細(xì)胞因子 IL-4的轉(zhuǎn)錄。 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞抗原 4(cycotoxic T lymphocyte associtated antigen-4，CTLA4)可抑制 GATA-3 mRNA 表達(dá)和 Th2 細(xì)胞分化。 報(bào)道顯示[18-19]，轉(zhuǎn)導(dǎo)子 GATA連接蛋白-3(GATA-3)和T細(xì)胞表達(dá)的 T 盒(T-bet)與 Th1/Th2平衡有關(guān)。因此，對(duì)妊娠結(jié)局而言，重要的是Th1/Th2的平衡。 在自然流產(chǎn)小鼠模型的相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)， 流產(chǎn)的發(fā)生與Th1型細(xì)胞因子增高，Th2型細(xì)胞因子下降有關(guān)；外源性抗原誘導(dǎo)妊娠免疫耐受的機(jī)制可能與其促使Th1向 Th2轉(zhuǎn)化，從而降低胚胎吸收率有關(guān)，中國最新研究表明，蛻膜組織中T-bet和GATA-3 表達(dá)異常與 URSA 發(fā)病相關(guān)[17]。

有研究報(bào)道，青藤堿可以對(duì)IL-2 膜受體的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用，但是不影響IL-2 的分泌，提示青藤堿治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一是調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抑制IL-2 膜受體[20]。另有研究認(rèn)為慢性腎炎患者的外周血有核細(xì)胞中T-bet mRNA 的水平高于健康對(duì)照組，給予青藤堿治療后，T-bet mRNA 的高水平被抑制，同時(shí)血清中IFN-γ的水平也被抑制。T-bet 對(duì) Th1細(xì)胞因子有正性調(diào)節(jié)作用，而 GATA-3 則正性調(diào)節(jié) Th2細(xì)胞因子的分泌，因此，T-bet/ GATA-3 的比率是一個(gè)反映 Th1/ Th2平衡的很好的指標(biāo)。有研究檢測(cè)原因不明的 RSA 婦女蛻膜組織中 T-bet、GATA-3 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) T-bet 表達(dá)增加而 GATA-3 表達(dá)下降，表明 T-bet、GATA-3 也參與了 RSA的發(fā)病過程。 本研究中，T-bet 和 GATA-3 在各組中的表達(dá)變化分別與 IFN-γ和 IL-4 的變化一致，即模型組孕鼠蛻膜組織中T-bet mRNA和蛋白表達(dá)量明顯高于正常組，而GATA-3 明顯低于正常組，提示 T-bet、GATA-3 表達(dá)的變化與 RSA有密切聯(lián)系，與以往研究結(jié)論一致[20]。這些研究均提示青藤堿可以直接或者間接抑制Th1 型細(xì)胞因子IFN-γ 和轉(zhuǎn)錄因子T-bet 的表達(dá)，從而影響Th1/ Th2 平衡。

多項(xiàng)研究表明，以 Th2型細(xì)胞因子為主的 Th1/Th2平衡可以導(dǎo)致免疫耐受從而維持正常妊娠，而RSA的免疫應(yīng)答過程則表現(xiàn)為以Th1型細(xì)胞因子為主的Th1/Th2失衡[13]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，模型組孕鼠蛻膜組織中 IFN-γmRNA和蛋白表達(dá)量以及外周血中 IFN-γ水平均明顯高于正常組，而IL-4明顯低于正常組，與以往研究結(jié)論一致，即 Th1 型細(xì)胞因子可以導(dǎo)致胎盤損傷胎兒發(fā)育受阻而引起流產(chǎn)，Th2 型細(xì)胞因子則對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育和維持妊娠有一定作用，RSA 的發(fā)生于 Th1/Th2 平衡偏向 Th1型有關(guān)。同時(shí)本研究中IFN-γ/IL-4 比值、T-bet/GATA-3 蛋白表達(dá)量與低于模型組但是高于正常組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明青藤堿可以調(diào)整Th1/Th2失衡情況。

本研究中，青藤堿可以減少復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的發(fā)生，其中RSA與Th1/Th2 平衡漂移至Th1 型有關(guān)；青藤堿治療復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的可能機(jī)制為降低體內(nèi)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及轉(zhuǎn)錄因子T-bet 的水平，從而調(diào)節(jié)Th1/ Th2 平衡。

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(編校：王冬梅)

Research the influences of sinomenine on pregnancy outcome of mice with recurrent spontaneous abortion and its mechanism

XIAO Li1,LI Kun2

(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Traffic Hospital in Shandong Province, Jinan 250031, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, The Affiliated Hospital of Shandong Provincial Academy of Medical Sciences, Jinan 250031, China)

ObjectiveTo investigate the influences and the mechanism of sinomenine on pregnancy outcome of mice with recurrent spontaneous abortion.MethodsAccording to the proportion of female and male 2:1 cage,60 female CBA/J mice, 20 male DBA/2 mice,10 Balb/c mice, it was detection of pessary which counted as first day of pregnancy.It was divided into three group,the normal group：female CBA/J mice×male Balb/c mice, normal diet,9 pregnant mice;Model group: female CBA/J mice×male DBA/2 mice, normal diet,10 pregnant mice;treatment group: female CBA/J mice×male DBA/2 mice, when self checking out the vaginal plug day, the mice were fed with containing 0.5% of sinomenine, 10 pregnant mice.Counting the number of embryos and embryos survive loss, and calculated the rate of embryo loss.ELISA method was used for the detection of serum cytokines, IFN-γ and IL- 4 level;the expression level of IL-4, INF-γ, GATA-3, T-bet gene were detected by real-time PCR;the level of IL-4, INF-γ, GATA-3, T-bet protein were measured by Western Blot method.ResultsRate of embryo loss results showed that: compared with the model group, the rate of embryo loss of the normal group and the treatment group was decreased significantly(P<0.01), the difference was statistically significant.ELISA results showed that: compared with the normal group, model group and treatment group in serum IFN-γ and IFN-γ/IL-4 levels were significantly increased (P<0.01), the levels of IL-4 were significantly decreased (P<0.01), the difference was statistically significant; compared with the model group, the treatment group in serum IFN-rlevel and the ratio of IFN-γ/IL-4 were significantly decreased (P<0.01), but the level of IL-4 changed little, no significant difference.The results of real-time PCR and Western blot indicated that compared with the normal group, the expression level of IL-4 and GATA-3 genes in model group and treatment group were significantly decreased (P<0.01); the expression level of IFN- γ, T-bet gene and IFN-γ/IL-4 ratio and T-bet/GATA-3 ratio were significantly increased (P<0.01).Compared with the model group, the expression level of IFN- γ, T-bet gene and IFN-γ/IL-4 ratio, T-bet/GATA-3 ratio in treatment group was significantly decreased (P<0.01). ConclusionSinomenine can effectively reduce the occurrence of recurrent spontaneous abortion.RSA and Th1/Th2 relate to drift balance to Th1,mechanism of sinomenine in treatment of recurrent spontaneous abortion may be to reduce the levels of Th1 type cytokines IFN-γ and transcription factor T-bet levels, thereby regulating the balance of Th1/ Th2.

sinomenine; recurrent spontaneous abortion; INF-γ; IL-4; T-bet; GATA-3

山東省自然科學(xué)基金課題項(xiàng)目(ZR2009CL027)；濟(jì)南市科技局科技明星計(jì)劃課題項(xiàng)目(20100118)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)基金課題項(xiàng)目(201023)

肖麗，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制及診療，E-mail：xl1821460022@163.com。

R714.21

A

1005-1678(2015)01-0063-05